2020 Fiscal Year Research-status Report
Isolation of adult tissue stem cell in the human anterior pituitary
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20K08896
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| Research Institution | Fujita Health University |
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Principal Investigator |
長崎 弘 藤田医科大学, 医学部, 教授 (30420384)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
金子 葉子 岐阜医療科学大学, 薬学部, 教授 (20319263)
小谷 侑 藤田医科大学, 医学部, 講師 (60644622)
河田 美穂 藤田医科大学, 医学部, 助教 (90761601)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 下垂体組織幹細胞 / 下垂体腫瘍 / 組織幹細胞 / 再生医療 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
下垂体腺腫は良性腫瘍が大半をしめる一方で、下垂体はホルモンの働きをコントロールし、生体機能維持の中枢を担う重要な器官であるため、良性腫瘍であるにも関わらず視野障害、下垂体前葉機能低下症、自律神経失調症や尿崩症などの重篤な障害を生ずる。また術後に後遺症が残る事も多い。
近年、齧歯類において、この下垂体の前葉組織内に成体幹細胞（PSC: Pituitary stem cells）が存在し、各種細胞へと分化能を有する事が示されている。その一方で、入手が困難であるヒトの下垂体組織における知見は非常に乏しい。
本研究は、下垂体腫瘍に対する術後後遺症の根治療法を目的とし、手術時に摘出される新鮮なヒト下垂体前葉組織よりPSCを同定し、分離培養を行う。この単離したPSCの未分化性を維持する条件を探索すると同時に、PSCの各種下垂体分化細胞への分化を制御できる様にする。これと同様に、下垂体腫瘍幹細胞（PASC: Pituitary adenoma stem cells）も同定、分離培養し解析する事で、これまで十分に知見の得られていないPSCとPASCの相違点も探る。
これらで得られた情報をもとに、将来的には、患者自身の細胞から作られたある特定の機能を有する下垂体細胞を、患者自身へ再び戻すための移植を試みる。これにより、通常おこなわれている術後治療に用いられていたホルモン補充療法等の生涯にわたる継続的な治療を必要とせず、日常生活に支障をきたす事ない、安全な治療を目指す。
これは高性能な再生医療に繋がるだけでなく、下垂体前葉細胞の恒常性維持機構解明の一端を担う成果を得る事ができる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまで齧歯類等で多くの研究者によってPSCの存在が確認されている。本研究における最初の重要な確認事項である、『ヒト下垂体組織にはPSCは本当に存在するのか。』という問いを明らかにするため、下垂体腫瘍手術で得られたヒトの摘出検体にて、既知の幹細胞特異的分子マーカーの抗体を用い免疫組織染色法をおこなった。今回 下垂体腫瘍手術時に得られた症例、非機能性腺腫 ７検体、先端巨大症 ２検体、粘液腺腫瘍再発 １検体、計10検体の組織を、幹細胞マーカーであるSox2・Sox9・s100βにて観察したところ、10検体全ての組織にて各幹細胞マーカーの陽性細胞を確認することができた。また、これらがPASC、またはPSCかを区別するため、ヘマトキシレン・エオジン染色にて細胞の形態を確認しつつ、幹細胞マーカーでの免疫染色法を同時に行ったところ、PASC、及びPSCの両方の存在が確認できた。
次に、存在が確認できたPSCを単離、培養するため、はじめに、入手が容易なラットを用い条件検討を行った。まず、ラット下垂体組織からPSCのみを単離するために、PSCに対し特異的な表面抗原として知られるCD9の抗体を用い、MACS法によりPSCの単離を行った。この単離した細胞を数日培養するとsphere形成をすることが確認でき、形成したsphereにGSK3B 阻害剤（細胞増殖抑制剤）等を加え、さらに培養することで神経細胞特異的分子マーカーβⅢtublin陽性細胞を確認する事ができた。現在、これら条件を確実にするため、各種下垂体ホルモン産生細胞特異的分子マーカーを用いるなど、さらに詳細な手技を確立しつつある。
これらの成果の一部を2020年度日本生理学会中部大会にてポスター発表を行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度に得た成果、ヒト下垂体組織にて存在が確認できたPSCとPASC、両者の性質の相違点を明らかにするため、前段階としてラット下垂体を用い実験をおこなう。そこで二者を比較解析する観点から、同じ下垂体前葉組織中で性質が異なると予測されている、MPSC（Merginal Pituitary stem cell：下垂体中葉と前葉との境界にあるPSC)とPPSC (Parenchymal Pituitary stem cell：前葉実質にあるPSC)の違いを解析する。まず、MPSCを含む領域と、PPSCを含む領域を 顕微鏡下で切り分け、各組織から分離した細胞を用い、以下の様に研究を進めていく。
１）MPSC 及びPPSC 両方のPSCで発現しているCD9抗体、またはヒトiPSC由来下垂体オルガノイドから同定した表面抗原Xを用い、MACSまたはFACS法より各PSCを単離し、これまでおこなってきた培養条件下で未分化性を維持し、また分化細胞へも誘導する。
２）single cell RNA-seqで解析し、両者の違い生み出す遺伝子を見つけ解析する。
これらの方法により、ラット下垂体前葉組織PPSCとMPSCそれぞれの特有の性質を導き出す。このラットでの実験はヒト検体組織の解析の準備実験という意味だけではく、齧歯類においてもこれまでに報告がなく、下垂体前葉細胞の発生及び恒常性維持の解明にも繋がる。また、人の摘出検体においても同様の解析をし、ラットの結果と比較する事で、臨床的な意義も得る。
さらに、本研究の手技を確実なものにするため、最近、報告された『下垂体組織から分離した細胞を平面培養にするとPPRX1/Sox2陽性のMPSCが増殖する（Shintani & Higuchi. 2021）』より、ヒトの摘出検体から分離した細胞においても同様の現象が観察されるか確認し、MPSCの単離を試みる。
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| Causes of Carryover |
昨年度に得た成果、ヒト下垂体組織にて存在が確認できたPSCとPASC、両者の性質の相違点を明らかにするため、前段階としてラット下垂体を用い実験をおこなう。そこで二者を比較解析する観点から、同じ下垂体前葉組織中で性質が異なると予測されている、MPSC（Merginal Pituitary stem cell：下垂体中葉と前葉との境界にあるPSC)とPPSC (Parenchymal Pituitary stem cell：前葉実質にあるPSC)の違いを解析する。前述の「今後の推進方策」の2) Single cell RNA-seqをラット下垂体を切り分けて、複数回（少なくとも2回）実施する必要がある。scRNA-seqは安価になったとはいえ、解析を含めると1回１００万円近いコストを要するため、2020年度の支出を極力減らし,2021年度に２検体の解析を行うための原資とした。
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