2020 Fiscal Year Research-status Report
Development of new immunotherapy for metastatic pancreatic cancer by applying organoids derived from circulating tumor cells in blood.
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20K08956
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
田邉 剛 山口大学, 大学院医学系研究科, 教授 (80260678)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
浅井 義之 山口大学, 大学院医学系研究科, 教授 (00415639)
山口 奈津 山口大学, 大学院医学系研究科, 助教 (40450671)
清木 誠 山口大学, 大学院医学系研究科, 教授 (50226619)
硲 彰一 山口大学, 医学部, 教授(寄附講座等) (50253159)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 膵がん / オルガノイド / CTC |
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| Outline of Annual Research Achievements |
膵がんは早期に転移するため予後不良であるが、転移の治療法は確立していない。免疫療法は有力な治療法の候補であるが、何を標的に免疫を誘導するかが問題となる。我々はリキッドバイオプシーによるがん早期診断法開発を進めており、対象の一つである血中循環腫瘍細胞（CTC）は原発巣から血中に遊離し転移巣を形成する。本研究では、転移巣モデルとしてCTCからオルガノイドを作製し、それを標的に免疫療法を開発して転移の治療に応用するという独自の着想から、以下3点を目的としている。
(A) CTCオルガノイドによる転移巣モデルを構築し、転移治療法開発における有用性を検証する。
(B) CTCオルガノイド特異的キラーT細胞を誘導し、転移に対する免疫細胞療法を樹立する。(C) CTCオルガノイドに発現するネオ抗原を同定し、転移に対するペプチド免疫療法を確立する。
2020年度は、(A)CTCオルガノイドの転移モデルの作製を目的として、ヒト膵がんCTCオルガノイドの作製を進めたが、樹立には至っていない。CTCの調整法および少数のCTCからのオルガノイド培養条件の検討を要すると考えられ、次年度以降の課題である。この間、膵がん転移モデルの作製を進めるため、マウス膵がんオルガノイドから樹立した膵がんオルガノイドをマウスに移植したところ、生着および転移が確認された。現在、詳細な組織解析を行っている。
上記に平行して、(B) CTCオルガノイド特異的キラーT細胞誘導法の確立を目的として、マウスモデルを用いた検討を進めた。マウス膵がんオルガノイドを、末梢血と共培養し膵臓がんに特異的に反応するリンパ球の誘導を行い、膵臓がん特異的リンパ球誘導に成功した。現在、詳細なリンパ球のマーカー解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
(A)CTCオルガノイドの転移モデルの作製
①膵がんCTCオルガノイドの作製: これまでに膵がん患者のCTCからオルガノイド培養を3例検討した。現時点では樹立ができていないことから、CTCの調整と、少数のCTC細胞からのオルガノイド培養条件の検討が必要だと考えられた。前者は、他のCTC調整法を検討する。後者は、既に作成済みのヒト膵がんオルガノイド細胞を用いて、少数の細胞からの培養条件を検討する。
②膵がん転移モデルの作製: ヒトCTCオルガノイドの代わりに、マウス膵がんモデルから樹立した膵がんオルガノイドを用いた。マウスに移植した膵がんオルガノイドは生着し転移がみられた。現在、転移先など詳細を組織解析している。
(B)CTCオルガノイド特異的キラーT細胞誘導法の確立
(A)のヒトの培養系が確立するまでに、マウスモデルを用いた検討を行った。マウス膵がんオルガノイドを、末梢血と共培養し膵臓がんに特異的に反応するリンパ球の誘導を行った。さまざまな培養条件の検討により、膵臓がん特異的リンパ球の誘導ができた。共培養7日で、CD8陽性のキラーT細胞が増加し、活性化マーカーCD69の増加から、活性化が起こっていると考えられた。より詳細なリンパ球のマーカー解析が進行中である。興味深いことに、共培養に用いる末梢血としては、正常より、担がんマウス由来の末梢血の方が、膵臓がん特異的リンパ球の誘導の効率が高かったことから、担がんマウスでは、膵臓がん特異的リンパ球のプライミングが起こっていると考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
(A)(1)今後は、ヒトCTCオルガノイド作製のための上記の２点についての詳細な条件検討を行う。(2)免疫不全マウスへ接種し、マウスでの転移モデルを作製する。(3)もし、ヒトCTCオルガノイド作製が難しい場合は、樹立済みのヒト膵がんオルガノイド細胞を用いて、同様の実験を進める。
(B)(1)ヒトCTCオルガノイドができ次第、マウス細胞を用いて樹立した培養条件を用いて、ヒトCTCオルガノイド特異的キラーT細胞誘導を行う。(2)令和2年度の実験で、共培養に用いる末梢血によって、膵臓がん特異的リンパ球の誘導が異なっていた。膵がん発症の時期に応じて、末梢血中の膵がん反応性リンパ球の性質が異なる可能性がある。膵がんモデルマウスでは、膵がんの発症が個体によって大きく異なる。そこで、膵がんオルガノイドを接種したマウスで、接種後のどの時期の末梢血を用いれば、共培養で膵臓がん特異的リンパ球の誘導が起こしやすいかを調べる。さらに、(3)キラーT細胞誘導の効率が良い培養条件を確定する。(4)誘導したヒト膵臓がんCTC特異的キラーT細胞を、ヒト膵がんCTCを接種した免疫不全マウスモデルに静注し、膵がん退縮能を検証する。
(C)CTCオルガノイドからのネオ抗原の同定
(1)CTCオルガノイドに特異的発現するRNAの選択： CTCオルガノイドと膵がん切除例非がん部組織についてRNA seqを行い、ネオ抗原を同定する。(2)がん細胞表面に提示されるペプチドの同定： CTCオルガノイドと膵がん切除例非がん部組織について、酸処理あるいは免疫沈降によって細胞表面ペプチドを回収し、質量分析法（LC-MS/MS）により同定する。(3) ウェット及びドライ解析による膵がん特異的抗原の同定： (C)②で得られた質量データを(C)①で作成した膵がん特異的タンパクデータベースで検索し、MHC-I結合ペプチドの同定を行う。
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| Causes of Carryover |
今年度はヒト膵がんCTCオルガノイドの完成に至らず、CTCオルガノイド細胞表面ペプチドの同定を開始しなかったため未使用額が生じた。未使用額については、2021年度の実験試薬の購入に充てる。
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[Journal Article] Gravity sensing in plant and animal cells2021
Author(s)
Takahashi Ken、Takahashi Hideyuki、Furuichi Takuya、Toyota Masatsugu、Furutani-Seiki Makoto、Kobayashi Takeshi、Watanabe-Takano Haruko、Shinohara Masahiro、Numaga-Tomita Takuro、Sakaue-Sawano Asako、Miyawaki Atsushi、Naruse Keiji
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Journal Title
npj Microgravity
Volume: 7
Pages: -
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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