2020 Fiscal Year Research-status Report

microRNA機能解析によるパクリタキセル耐性機序の解明と不応性の克服

Research Project

Project/Area Number	20K08971
Research Institution	Osaka Medical College
Principal Investigator	木村光誠大阪医科大学, 医学部, 講師 (20623846)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	谷口高平大阪医科大学, 医学部, 講師 (70779686)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	microRNA / パクリタキセル耐性株 / ABCB1 / 抗癌剤耐性
Outline of Annual Research Achievements	進行再発乳癌は集学的治療を用いても、依然として予後不良である。原因として、抗癌剤耐性獲得による奏功性の低下がある。本研究では、乳癌化学療法で頻用するタキサン系薬剤Paclitaxel(以下PTX)の薬剤耐性機序をmicroRNA(miRNA)の発現変化から解明する。本研究で使用する細胞はMCF-7(親株)、MCF-7/PTXR(PTX耐性株)である。予備実験でMCF-7とMCF-7/PTXRに対し、miRNAの次世代シーケンス解析を実施し、miRNAの挙動を網羅的に解析した。また、MCF-7/PTXRにおいて、PTXの細胞外排出を行うP糖タンパクであるABCB1の発現亢進も認めており、ABCB1を標的とするmiRNA群の機能解析も行った。まず、耐性株で最も発現が低下したmiRNA-196a、発現が上昇したmiRNA-3925-3pについて検証したが、PTXに対する感受性の改善を認めなかった。一方でWebデータからは、miRNA-455-3pがABCB1に結合することが示唆された。そこで、miRNA-455-3pを耐性株に導入すると、PTXに対するIC50の改善とABCB1のタンパク発現低下を認めた。これより、miRNA-455-3pがABCB1の翻訳の抑制を介して、PTXに対する耐性を一部解除している可能性が示唆された。また、PTX耐性獲得に際し、miRNA-455-3pの発現低下によりABCB1の発現が亢進し、PTX耐性に関与している可能性がある。次に、miRNA-455-3pとABCB1の結合性を検証するために、ABCB1の相補塩基配列部位を組み込んだプラスミド(野生型)と、相補塩基配列部位に変異を組み込んだプラスミド(変異型)を作製し、Luciferase Reporter Assayを行い、野生型ではABCB1の発現抑制を認めた。現在、変異型について検証中である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 耐性株で最も発現が低下していたmiRNA-196a、発現が上昇していたmiRNA-3925-3pについて研究を進めたが、PTXに対する感受性の改善を認めなかった。一方でWebデータからは、miRNA-455-3pがABCB1に結合することが示唆されたため、miRNA-455-3pを耐性株に導入したところ、PTXに対するIC50の改善を認めた。同時に、ABCB1のタンパク発現の低下を認めた。このことから、miRNA-455-3pがABCB1の翻訳の抑制を介して、PTXに対する耐性を一部解除している可能性が示唆された。これらの結果から、PTX耐性獲得に際して、miRNA-455-3pの発現低下によりABCB1の発現が亢進し、PTX耐性に関与している可能性が示唆されている。また、親株にmiRNA-455-3p inhibitorを導入し、PTXに対する耐性を獲得するかを検証したが、IC50の上昇は認めなかった。親株はもともとABCB1の発現が少ないため、miRNA inhibitorを導入した場合の変化が捉えにくかった可能性を考えている。そこで、親株を用いた検証にはABCB1過剰発現プラスミドを作製し、再度検証予定である。
Strategy for Future Research Activity	miRNA-455-3pとABCB1の結合性を検証するために、ABCB1の相補塩基配列部位を組み込んだプラスミド(野生型)と、相補塩基配列部位に変異を組み込んだプラスミド(変異型)を作製し、Luciferase Reporter Assayを行う。野生型ではABCB1の発現抑制を認め、現在、変異型について検証中である。また、ABCB1を過剰発現させたプラスミドを作製し、PTX耐性との関連を調べる。プラスミド導入株にmiR455-3pを導入し、コントロール群と比較して耐性が解除されていることを確認する。
Causes of Carryover	ほぼ予定通りに進んでいるが、一部の実験結果に対して再現性を確認する必要があったため、少し計画が変更になり若干の次年度使用額が生じた。また、次年度はLuciferase Reporter AssayおよびABCB1過剰発現プラスミドを用いた実験を行うため、その費用に研究費を使用する予定である。