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2020 Fiscal Year Research-status Report

Tissue Engineered Islets derived from glucosensitive Beta cells

Research Project

Project/Area Number 20K08972
Research InstitutionFukuoka University

Principal Investigator

小玉 正太  福岡大学, 医学部, 教授 (90549338)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 田中 智子  福岡大学, 医学部, 講師 (10380528)
坂田 直昭  福岡大学, 医学部, 准教授 (50431565)
吉松 軍平  福岡大学, 医学部, 准教授 (50569275)
Project Period (FY) 2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords膵β細胞 / グルコセンサー / GLUT2 / Ca inflex / MIP-GFP Tg / Fura-2AM 標識 / 高感度血糖応答性 / 組織工学的膵島
Outline of Annual Research Achievements

β細胞にはイオンチャンネル輸送器官として Na+/Ca2+ 交換に寄与するNCXやTRPV4などが細胞膜に存在し、インスリンの分泌過程に反応系として必須の役割を担っている。我々は以前、このNCX拮抗剤をドナー膵島の移植前培養に用いることにより、移植効率の改善をもたらした事を報告している。この時にMIP-GFP マウス膵島から単細胞化したβ細胞を用いて、Fura-2AM 標識されたCa2+の取り込み実験を行ない、阻害剤を用いた時にはCa2+の流入が生じなかったことを結果として示した。この一連のCa2+の流入の動態より、GULT2より取り込まれたGlucoseの反応系を捉える事が出来ることに今回着眼した。
グルコースはGLUT2のトランスポーターを介してβ細胞内へ取り込まれ、ミトコンドリアでATP産生による細胞内濃度勾配変化により、ATP依存性K+チャンネルによる細胞膜での脱分極が起こりCa2+チャンネルが開くことでCa2+が細胞内に流入しインスリン顆粒が分泌する。この過程で膵島単離後 Single cell 化された、MIP領域に GFP が標識された MIP-GFP Tgマウスのβ細胞を用いることで、インスリン蛋白がGFPで標識されている細胞が cell sorting を経て供給される。これらの single cell 化されたβ細胞にグルコース濃度が200mg/dl, 400mg/dl の培養液で培養し RFP標識されたCa2+の取り込後の細胞を再度 cell sorting により選別後、今年度はクラスター解析を行い候補遺伝子の選定を行う予定であった。
ところが、C57BL/6 MIP-GFP Tg ♂の交配が進まず、クラスター解析には至らなかったが、現在β細胞選択はないものの、 Ca inflex のみの実験でsorting gate 設定を進めている。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

COVID19 流行に伴う緊急事態宣言の規制下において、構内への入校制限が制限されたため、アニマルセンター内への入構とそれに伴うマウス管理が適わず、C57BL/6 MIP-GFP Tg ♂の交配が進まなかった結果、コロニーの維持が不可能となった。そのため、米国 Jackson Laboratory から再度輸入を行なったが、通常の手続きも大幅に遅れたのち交配を再開している。本来β細胞選択肢を保持しCa inflexの実験を施行する予定であるが、膵島からの single cell で sorting gate 設定を行い、実験を進めている。しかしながら、Ca2+の取り込モデルマウス: Tg(ins: GCaMP2) x Tg(ins: cdt1-mCherry)の作製に関しては、既にコンストラクトが作製済みであるためにC57BL/6 background でモデルマウス作製を依頼している。遺伝子改変動物を作成することで、数多くの動物から単離した初代細胞を用いて、より詳細な遺伝子属性に起因する機能解析が大きなスケールで可能となるためである。2009年樹立したβ細胞など内分泌単細胞からの膵島細胞再編手技を用いて、中等度高血糖反応型膵島と高度高血糖反応型膵島の組織工学的膵島を再編し、in vitro 実験にて血糖応答性を確認するための準備を行なっている。

Strategy for Future Research Activity

(1) グルコセンサーの同定
C57BL/6 MIP-GFP Tg ♂の膵島を単離し、single cell 化する。β細胞のみを GFP+ 細胞として sorting し、(予備実験で 140mg/dl), 200mg/dl, 400mg/dl で Ca2+の取り込み実験を行う。正常血糖(100mg/dl)、中等度高血糖(200mg/dl)、高度高血糖(400mg/dl)群でCa2+が取り込まれたβ細胞を再度sorting し、サンプルのクラスター解析でグルコセンサー候補遺伝子を選定する。
(2) Ca2+の取り込モデルマウス: Tg(ins: GCaMP2) x Tg(ins: cdt1-mCherry)の作製
コンストラクトは既に作製済みであるためにC57BL/6 background でモデルマウス作製を依頼する。遺伝子改変動物を作成することで、数多くの動物から単離した初代細胞を用いて、より詳細な遺伝子属性に起因する機能解析が大きなスケールで可能となる。2009年樹立したβ細胞など内分泌単細胞からの膵島細胞再編手技を用いて、中等度高血糖反応型膵島と高度高血糖反応型膵島の組織工学的膵島を再編し、in vitro 実験にて血糖応答性を確認する。
(3) 血糖高感度β細胞とその候補遺伝子の発現阻止細胞各々の不死化 cell line 作製
(1)で得られた結果を(2) で作製されたモデルマウスで検証し、選別された細胞にSV40の導入を行い血糖高感度β細胞とその候補遺伝子の発現阻止細胞の不死化した cell line を作製する。Cell line を用いて中等度と高度に血糖へ反応する膵島のイオンチャンネル・トランスポーターに標的を絞り、培養細胞でそれらの相補性を確認するため、Realtime PCR array を用い評価する。

  • Research Products

    (23 results)

All 2021 2020

All Journal Article (7 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Peer Reviewed: 7 results,  Open Access: 7 results) Presentation (16 results) (of which Int'l Joint Research: 3 results,  Invited: 1 results)

  • [Journal Article] Xenotransplantation of neonatal porcine bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves murine hind limb ischemia through lymphangiogenesis and angiogenesis.2021

    • Author(s)
      H, Sakata N, Nishimura M, Tanaka T, Shimizu M, Yoshimatsu G, Kawakami R, Wada H, Sawamoto O, Matsumoto S, Kodama S.
    • Journal Title

      Xenotransplantation

      Volume: - Pages: -

    • DOI

      10.1111/xen.12693

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Lymphangiogenesis and angiogenesis rescue murine ischemic hindlimb via transient receptor potential vanilloid 42021

    • Author(s)
      Yamada H, Sakata N, Tanaka T, Tagashira H, Yoshimatsu G, Kawakami R, Wada H, Iwamoto T, Kodama S
    • Journal Title

      Journal of Pharmacological Science

      Volume: - Pages: -

    • DOI

      10.1016/j.jphs.2021.04.009

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Inhibition of NLRP3 inflammasome by MCC950 improves the metabolic outcome of islet transplantation by suppressing IL-1β and islet cellular death.2020

    • Author(s)
      Matsuoka T, Yoshimatsu G (Corresponding author), Sakata N, Kawakami R, Tanaka T, Yamada T, Yoshida Y, Hasegawa S, Kodama S.
    • Journal Title

      Sci Rep.

      Volume: 10 Pages: 17920

    • DOI

      10.1038/s41598-020-74786-3

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Mechanism of Transplanted Islet Engraftment in Visceral White Adipose Tissue.2020

    • Author(s)
      Sakata N, Yoshimatsu G, Tanaka T, Yamada T, Kawakami R, Kodama S.
    • Journal Title

      Transplantation.

      Volume: 104 Pages: 2516-2527

    • DOI

      10.1097/TP.0000000000003400

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] White Adipose Tissue as a Site for Islet Transplantation.2020

    • Author(s)
      Naoaki Sakata, Gumpei Yoshimatsu, Shohta Kodama
    • Journal Title

      Transplantology

      Volume: 1 Pages: 55-71

    • DOI

      10.3390/transplantology1020006

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] The Roles of Collagen in Islet Transplantation2020

    • Author(s)
      Sakata Naoaki、Yoshimatsu Gumpei、Kodama Shohta
    • Journal Title

      OBM Transplantation

      Volume: 4 Pages: -

    • DOI

      10.21926/obm.transplant.2004127

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Outcomes of Islet Autotransplantation in Chronic Pancreatitis Patients with Complete Acinar Atrophy.2020

    • Author(s)
      Yoshimatsu G , Kanak MA, Vasu S, Kumano K, Lawrence M, Onaca N, Takita M, Levy MF, Naziruddin B.
    • Journal Title

      Cell Tranaplantation

      Volume: 29 Pages: -

    • DOI

      10.1177/0963689720949242

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Presentation] “Bioartificial islets, composed by alginate-poly-L-ornithine-alginate (APA), three layered microencapsulated neonatal porcine islets (NPIs) - Is it a realistic option to supply as clinical islet xenotransplantation (xenoTx) ?“2021

    • Author(s)
      Shohta Kodama
    • Organizer
      The 2nd Congress of Asian Pancreas and Islet Transplant Association
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] 保険診療のもとでの膵島移植の現状と未来2021

    • Author(s)
      小玉正太
    • Organizer
      第48回日本膵・膵島移植研究会
  • [Presentation] 異種移植の新規展開と臓器再生2021

    • Author(s)
      小玉正太
    • Organizer
      第20回日本再生医療学会総会
  • [Presentation] 脂肪被覆膵島移植とその手法2021

    • Author(s)
      坂田直昭
    • Organizer
      第20回日本再生医療学会総会
  • [Presentation] The protocol of fat-covered islet transplantation using epididymal white adipose tissue2021

    • Author(s)
      Naoaki Sakata
    • Organizer
      The 2nd Congress of Asian Pancreas and Islet Transplant Association
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 臨床異種膵島移植実現のためのマイクロミニブタを使用した膵島単離と回収膵島の機能評価2021

    • Author(s)
      坂田直昭
    • Organizer
      第23回日本異種移植研究会
  • [Presentation] NR5A1誘導性ステロイド産生細胞の移植による副腎不全モデルのレスキュー2021

    • Author(s)
      田中智子
    • Organizer
      第20回日本再生医療学会
  • [Presentation] 膵臓移植における糖尿病内科医と移植外科医との連携2021

    • Author(s)
      吉松軍平
    • Organizer
      第48回日本膵・膵島移植研究会
  • [Presentation] Laparoscopic complete mesocolic excision and central vascular ligation for right hemicolectomy2021

    • Author(s)
      吉松軍平
    • Organizer
      第33回日本内視鏡外科学会総会
  • [Presentation] 膵島細胞研究の新たな展開2020

    • Author(s)
      小玉正太
    • Organizer
      第58回日本糖尿病学会九州地方会
  • [Presentation] The Mechanism How the Transplanted Islets Engraft Into White Adipose Tissue2020

    • Author(s)
      Naoaki Sakata
    • Organizer
      2020 American Transplant Congress
  • [Presentation] The advanced mechanisms of islet-engraftment onto white adipose tissue2020

    • Author(s)
      Naoaki Sakata
    • Organizer
      TTS2020
  • [Presentation] 副腎皮質癌の新規治療標的としてのNR5A1の複数エキソン除外制御機構2020

    • Author(s)
      田中智子
    • Organizer
      第93回日本内分泌学会学術総会
  • [Presentation] NR5A1 RNAのスプライシング調節を介したNR5A1発現抑制:各種薬剤の検討2020

    • Author(s)
      田中智子
    • Organizer
      第93回日本内分泌学会学術総会
  • [Presentation] 膵の硬度からみた膵全摘自家膵島移植の適応について2020

    • Author(s)
      吉松軍平
    • Organizer
      第56回 日本移植学会オンライン総会
  • [Presentation] Inhibiting NLRP3 inflammasome ameliorates glucose fluctuation through reducing apoptosis and infiltration of inflammatory cells after intraportal islet transplantation in rodent model2020

    • Author(s)
      吉松軍平
    • Organizer
      American Transplant Congress
    • Int'l Joint Research

URL: 

Published: 2021-12-27  

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