2020 Fiscal Year Research-status Report
肝芽腫細胞間を連結する細胞膜ナノチューブの構造解析とがん悪性化に関わる役割
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20K08990
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| Research Institution | Saitama Medical University |
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Principal Investigator |
藤田 恵子 埼玉医科大学, 医学部, 准教授 (80173425)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 肝芽腫 / 細胞膜ナノチューブ / がん微小環境 / がん悪性化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞膜が細長く伸長したチューブ構造、細胞膜ナノチューブ（membrane nanotube）は隣接する細胞だけでなく遠隔にある細胞同士も物理的に連結し、細胞間コミュニケーションをダイレクトに司る新しいシステムとして注目されている。細胞間コミュニケーションは腫瘍の微小環境において異種性を誘発する重要な因子である。細胞膜ナノチューブは、離れた細胞同士を直接連結し、ミトコンドリア、マイクロRNA、細胞質シグナルなどを効率よく伝達するとされている。
これまで、小児悪性腫瘍の肝芽腫における微小環境（ニッチ）の特性について検討してきた。今年度、ヒト肝芽腫細胞間における細胞膜ナノチューブの形成とその特徴について検討した。
実験にあたり、肝芽腫細胞株(JCRB0401, HUH-6 Clone 5)を用いて肝芽腫細胞培養実験モデルを作成した。２次元培養によって肝芽腫細胞間の細胞膜ナノチューブを観察した後、固定細胞ならびに生細胞に対し免疫染色を行った。
細胞膜ナノチューブの形成を誘導する細胞内タンパク質として同定されたM-Sec（Tnfaip2）の発現部位を免疫組織学的に調べた。これと同時に、がん細胞の増殖を促進するとされるmTOR（mammalian target of rapamycin）、腫瘍形成・転移に関与するIL-６受容体の局在についても検討した。これらの局在について光学顕微鏡で観察した後、試料の同部位を走査型電子顕微鏡（SEM）で観察した。
細胞膜ナノチューブにはアクチンのみを含む細いチューブと、アクチンおよび微小管の両方を含む比較的太いチューブがみられた。細胞膜ナノチューブにおける物質輸送について確認するために、細胞骨格とモータータンパク質（ミオシン、キネシン）との関係を免疫組織学的に検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
新型コロナウィルス感染症（COVID-19）の影響により、医学部学生のカリキュラムが大幅に変更され、講義・実習の実施時期ならびに実施方法がかわったため、当初の計画通りに実験を進めることができなかった。
このため、実験の進捗状況はやや遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞膜ナノチューブの構造と役割の解明、肝芽腫幹細胞と微小環境の関係の解明を目的として実験を行う。
2020年度に予定していたが、実施できなかった実験を引き続き行っていく予定である。
具体的には細胞骨格（アクチン・微小管）とそのモータータンパク質（ミオシン・キネシン）の関係、細胞膜ナノチューブを輸送されると報告されているミトコンドリアの解析を行う。
また、光学顕微鏡により観察した同一試料を電子顕微鏡で観察する新しい観察法、光-電子相関顕微鏡法(CLEM)を用いて、走査型電子顕微鏡(SEM)による細胞膜ナノチューブの構造解析を行う。この実験には2020年度に購入したSEM観察用の特殊試料台を用いる予定である。
さらに、細胞膜ナノチューブによる物質輸送と肝芽腫細胞の悪性化の関係について明らかにする。通常培養と同時に低酸素・低栄養培養下で肝芽腫細胞を培養し、さらに薬物添加の影響についても調べる。細胞分裂時に発現するKi-67、がん細胞転移を促進すると報告されているポリアミンによる免疫染色を実施する。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウィルス感染症（COVID-19）の影響により、医学部学生のカリキュラムが大幅に変更され、講義・実習の実施時期ならびに実施方法がかわったため、当初の計画通りに実験を進めることができなかった。このため、実験の進捗状況はやや遅れ、次年度使用額が生じた。
細胞膜ナノチューブを輸送されると報告されているミトコンドリアの解析を実施するための試薬（免疫染色用の抗体等）、光学顕微鏡により観察した同一試料を電子顕微鏡で観察する新しい観察法である光-電子相関顕微鏡法(CLEM)を用いて、走査型電子顕微鏡(SEM)による細胞膜ナノチューブの構造解析を行うための試薬（コーティング試薬等）の購入に充てる。
さらに、低酸素培養実験に必要な試薬・装置を購入する予定である。
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