Fabrication of bioengineered sphincter construct with myoblast sheet

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K09012
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 金高 賢悟 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 教授 (10549570)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 江口 晋 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 教授 (80404218) ; 丸屋 安広 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 助教 (20817085) ; 堺 裕輔 九州大学, 工学研究院, 助教 (10608904)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 再生医療 / 筋芽細胞 / 括約筋

Outline of Annual Research Achievements

細胞シートのさらなる進化として生体材料である利点を生かした生理学的な機能の付加が期待される。加齢や疾病に伴う括約筋機能の低下は消化管においては逆流性食道炎、便失禁など尿路において排尿障害など種々の病態を引き起こし生命危機に直結しないものの生活の質QOLの著しい低下をきたす。これらの改善のため、括約筋の再生医療を目的として、薬剤に反応し収縮能を持つ細胞シートContractile cell sheetを作製、次に細胞シートを輪状に立体配置して管状構造にすることで収縮能を持つ管状収縮帯neo-spincterの作製を行う。
今年度は以下を計画していたが、コロナ禍のため出張による情報収集、他施設による実験内容の相談などが行えておらず、進捗が認められない状況である。
1.ラットの大腿筋より筋芽細胞を分離調整し、筋細胞への分化を誘導するためストレス誘導剤（ツニカマイシン、タプシガルジンなど）にて短時間処理した後、増殖因子の少ない貧栄養培地にて培養する。Total RNAを抽出した後に逆転写酵素を用いてcDNAに逆転写し、それを鋳型にMyoD,Myogeninのprimerを用いてqRT-PCRで増幅、定量し、筋芽細胞、筋細胞への分化を確認する。
2.収縮能獲得に重要な筋線維の走行を揃えるため、コラーゲン膜コーティング培地にてconfluentになった状態で培養細胞進展装置を用いて進展刺激を与える。経時的に顕微鏡下にて細胞の形質変化を観察するとともにRT-PCR方にて筋芽細胞→筋管細胞→筋線維のマーカーであるMyoD,Myogenin遺伝子などの発現を再度確認する。
3.収縮能を有する筋芽細胞の培養が確立された後、同様な培養系の温度応答性培養皿上に再現することで収縮能を有する筋細胞シートの作製を試みる。基盤技術を確立するためマウス骨格筋芽細胞株C2C12細胞を用いて実験を推進する。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

新型コロナウイルス感染拡大の影響により、出張による情報収集、他施設による実験内容の相談などが行えておらず、現在のところ進捗が認められない状況である。

Strategy for Future Research Activity

次年度もコロナ禍の影響が継続すると考えられるため、引き続き出張や他施設訪問による情報収集、技術指導は困難と考えられる。今後、筋組織再生にて先進的施設である東京女子医科大学のラボにウェブなどを用いて遠隔相談を行いながら「収縮能を有する筋芽細胞シート"Contractile cell sheet"の作製」「筋芽細胞シートによる管状収縮帯"Neo-sphincter"作製」を進めていきたい。また、並行して「大動物を用いた消化管括約筋再生実験」に向けて準備を進めていく予定である。

Causes of Carryover

コロナ禍の影響にて出張による情報収集、他施設による実験内容の相談などが行えず、次年度使用額が生じている。
次年度実施予定の「収縮能の有する筋芽細胞シート"Contractile cell sheet"の作製」「筋芽細胞シートによる管状収縮帯"Neo-sphincter"作製」に必要な試薬や消耗品の購入費として使用する予定である。