Fabrication of bioengineered sphincter construct with myoblast sheet

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K09012
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 金高 賢悟 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 教授 (10549570)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 江口 晋 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 教授 (80404218) ; 丸屋 安広 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 客員研究員 (20817085) ; 堺 裕輔 九州大学, 工学研究院, 准教授 (10608904)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 再生医療 / 筋芽細胞 / 細胞シート

Outline of Annual Research Achievements

現在医師主導治験を進めている細胞シートのさらなる進化として生体材料である利点を生かした生理学的な機能の付加が期待される。加齢や疾病に伴う括約筋機能の低下は消化管において逆流性食道炎、便失禁など、尿路系においては排尿障害など種々の病態を引き起こし生命危機には直結しないものの生活の質の著しい低下を来す。これらの改善のために括約筋の再生医療を目的として薬剤に反応して収縮を行う細胞シートcontractile cell sheetの作成に着眼した。また次のステップとして細胞シートを輪状に立体配置して環状構造を形成することで収縮能を持つ環状収縮帯の再生を計画している。今年度は以下の進捗を得た。
1.収縮能の獲得に重要な筋繊維の走行をそろえるべく、コラゲン膜コーティング培地にてconfluentな状態にて伸展刺激を加え刑事的に細胞形質変化を観察することを目的として細胞伸展刺激装置（オレンジサイエンス株式会社）を用いて、筋芽細胞の培養を行った。培地に伸展刺激を与えて筋細胞への分化過程を検証した。結果としてはインキュベータ内での培養が困難であったため短期的は組織学的な観察による変化の確認にとどまった。そのため形質変化に伴って筋芽細胞、筋管細胞、筋繊維のマーカーであるMyoD、Mogenin遺伝子の発現をRT-PCRにて確認することは困難であった。
2.ブタ小腸を脱細胞化し、extracellular matrix(ECM)の作成を行った。作成にはSDSなど界面活性剤ではなく、管腔構造の組織に最適な酵素液浸漬法を用いた。作成したECMに筋芽細胞株より作成した細胞シートを貼付し、漿膜側および内腔粘膜側に貼付した場合の細胞増殖、分化について組織学的に検討した。今後は実験数を増やして結果を考察する予定である。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

新型コロナウィルス感染の影響により出張による情報収集や他施設による実験内容の相談や共同研究などが行えておらず、今年度はある程度の進捗が認められた状況であるものの予定よりかなり遅れている状況である。

Strategy for Future Research Activity

コロナ禍が収束してきたため、他施設訪問による情報収集や、技術指導などを積極的に展開する。筋組織再生にて先進的施設であるラボなどに遠隔相談を行い、
「収縮能を有する筋芽細胞シートcontractile cell sheetの作成」を進めていきたい。ラット大腿筋より採取するprimary cultureからの筋芽細胞分離は、頭数
の確保などの点で困難であると判断し、確立された筋芽細胞株の使用も視野にいれたい。本年度は大学院生などの人材を確保可能であったことより、平行して動
物実験も進めていく予定であるが、現時点にて大幅に進捗が遅れていることより、大動物実験が困難な場合はより頭数が確保しやすいrodentを用いた系に変更し
つつin vivo実験に取り組む予定である。

Causes of Carryover

研究の進捗が遅れており、そのために物品費などに関して余剰が生じた。
動物実験に使用する動物の購入、樹立筋芽細胞株の購入に充てる予定である。