膵管内乳頭粘液性腫瘍の進展を担う分子機構の解明

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K09025
• Research Institution: Asahikawa Medical College
• Principal Investigator: 今井 浩二 旭川医科大学, 医学部, 講師 (10516420)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 水上 裕輔 旭川医科大学, 医学部, 教授 (30400089) ; 唐崎 秀則 医療法人徳洲会札幌東徳洲会病院医学研究所, 外科的消化器病疾患研究部, 客員研究員 (50374806)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 膵癌 / IPMN / 浸潤 / 分子機構

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、膵管内乳頭粘液性腫瘍（以下、IPMN）の外科切除材料を用いて、詳細な病理マッピングと多領域分割シーケンスにより、分子異常に関わる情報を得て「浸潤癌を発生しやすいIPMN」の特徴を明らかにすることを目的とする。ひとかたまりに見える嚢胞性病変もポリクローナルである可能性を考慮し、形態学的な特徴を基に領域別に遺伝子解析を行う方針とした。
2020年度には、浸潤癌を含まない6例のIPMN切除症例を対象に、5mm間隔で全割した標本から上皮内成分のうち異型度や粘液形質の異なるコンポーネントに分け、さらに肉眼的正常膵に分布する微小病変、膵管内播種が想定される病変をマッピングした。症例あたり10-90カ所の領域を特定し、半数の症例において核酸抽出を試みたが、連続切片における消失や、ターゲットシーケンスに必要な10ng以上のゲノムDNAの確保が困難な領域が、全体の約3割に確認された。ターゲットシーケンスは、KRAS及びGNASに加え、high-grade dysplasiaや浸潤癌の形成に必要とされるTP53, SMAD4, CDKN2A等の変異をカバーしたコンパクトパネルを用いて、Ion GeneStudio S5 systemにより解析した。シーケンス精度の確認のため、デジタルPCR法によりKRAS及びGNASのhot spot変異の検出とvariant frequencyの定量も行った。また、10ng以上のゲノムDNAの確保ができなかった領域については、同様にデジタルPCR法によりKRAS及びGNAS変異の特定を試みた。
結果、少数のゲノムマーカーによっても各領域におけるクローン類縁性と、これらの空間的な分布の推定がある程度可能な事が分かった。一方で、腫瘍性病変の組織学的異型度が増す過程においては、遺伝子変異が蓄積していくだけではなく、negative selectionによる喪失する遺伝子変異も報告されていることから、ターゲットシーケンスの解析対象にRNF43やKLF4等を追加する必要があると考えた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の目標症例数に概ね到達しているが、肉眼的正常膵に分布する微小病変（背景病変）の遺伝子解析を行う際に、十分な核酸が得られないことを経験した。

Strategy for Future Research Activity

2021年度はFFPE材料を用いて連続切片から病変由来の核酸を得る際高いシーケンス成功率を得るために微小病変に一定の選択基準を設けなどの工夫を行う。癌抑制遺伝子のコピー数異常を含めた変異プロファイリンを行うため、ターゲットシーケンス用のパネルの再設計も計画している。

Causes of Carryover

症例集積がやや遅れているため、解析に必要な研究費が次年度にずれ込んだ。また、コロナ禍のため旅費は発生しなかった。