2020 Fiscal Year Research-status Report

分子バーコードNGSによるリキッドバイオプシー：胃癌免疫化学療法の病勢・効果予測

Research Project

Project/Area Number	20K09055
Research Institution	Osaka University
Principal Investigator	黒川幸典大阪大学, 医学系研究科, 准教授 (10470197)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	小林登大阪大学, 医学部附属病院, 医員 (60835239)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	分子バーコード / リキッドバイオプシー / 次世代シーケンサー / 胃癌
Outline of Annual Research Achievements	Circulating tumor DNA (ctDNA)は癌患者の血液中に微量に存在する腫瘍由来のDNAであり、体内腫瘍量のモニタリング法として、あるいは非侵襲的に腫瘍の遺伝子変異を検出する方法(Liquid biopsy)として臨床応用されつつあるが、検出感度が低いことが課題とされている。また、本研究で対象とする胃癌において、①特異的な腫瘍マーカーが存在しない、②2017年に保険承認されたNivolumabの奏効率は胃癌では約10%と低く、奏効症例を事前に予測するバイオマーカーの開発が必要、上記２点の問題点がある。本研究では、分子バーコードを用いた次世代シーケンサーを利用することで、検出感度を向上させながらctDNA解析を行い、ctDNAが胃癌に対する化学療法の効果判定に有用なマーカーとなり得るか、さらには検出した遺伝子変異のタイプや総変異量によってNivolumab治療の効果予測が可能かどうかを検討することを目的とする。令和２年度には、以前より回収を開始していた切除不能進行胃癌もしくは術前化学療法を施行した患者を対象に血液サンプルの回収・処理・凍結を継続した。また、回収したサンプルの内、Nivolumab投与症例を含む15症例の血漿より計33検体よりCirculating Nucleic Acid Kit（Qiagen）を用いてcfDNAを抽出した。加えて、FFPEより原発巣の情報を抽出する目的で、血液採取可能であった症例の内、当院で手術を施行した症例のFFPEよりQIAamp® DNA mini kitを用いてDNA抽出を行なった。また、本研究では、対象遺伝子を20遺伝子に限定したターゲットシークエンスを行うこととしており、カスタムパネルを作成し、次世代シークエンサーによるFFPEと血漿のシークエンスを行っているところである。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 令和２年度の計画としては、組織の収集とDNAの抽出およびシーケンスを予定としていた。現在までに、血液検体の収集、DNA抽出、シークエンスは順調に進んでいる。今回の研究の目的は、病勢との相関、Nivolumabの治療効果予測のバイオマーカーの探索であり、ターゲット遺伝子は、他癌でNivolumab治療の効果予測マーカー候補と報告のある遺伝子を含む以下の20遺伝子に決定した。（TP5、ARID1A、CDH1、BRCA2、ARID1B、ATM、PIK3CA、APC、MUC6、AKT1、ERBB2、CCNE1、KRAS、CDK6、EGFR、FGFR1、FGFR2、MET、RHOA、SMAD4）上記遺伝子のカスタムパネルを作成し、depth of coverageについては、FFPEは100×、血漿は20000×に設定し、シークエンスを行っているところである。
Strategy for Future Research Activity	現在シークエンスを行っている検体については、結果が得られ次第順次解析を行い、原発巣と血漿の遺伝子変異の一致割合を出す予定である。ついで、血漿について、シークエンス結果の解析から得られた遺伝子変異の有無と化学療法、Nivolumabによる治療効果やその他臨床病理学的因子との関連につき検討を行う予定である。更に、各症例について、複数ポイントでの血液採取を行なっているため、病勢とctDNAの量の相関についても検討する予定である。さらなる検体の収集を行い、同一症例での解析ポイントを増やし、解析症例についても増やすことを検討している。
Causes of Carryover	コロナウィルスによる緊急事態宣言が発令され、研究活動が停止となった期間があり、研究の進捗状況に遅れが生じたため