2021 Fiscal Year Research-status Report

Molecular mechanism of metastasis, invasion, and resistance to chemo-/radiotherapy in hepato-biliary and pancreatic malignancies

Research Project

Project/Area Number	20K09069
Research Institution	Osaka International Cancer Institute
Principal Investigator	和田浩志地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪国際がんセンター(研究所), その他部局等, 消化器外科副部長 (00572554)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	山田大作大阪大学, 医学系研究科, 助教 (60571396) 長谷川慎一郎地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪国際がんセンター(研究所), その他部局等, 消化器外科医長 (60621026) 高橋秀典地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪国際がんセンター(研究所), その他部局等, 消化器外科副部長 (90601120)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	エクソソーム / microRNA / 肝細胞癌 / 胆道癌 / 膵臓癌 / 低酸素
Outline of Annual Research Achievements	肝胆膵領域癌における転移・浸潤・治療抵抗性に関する分子機構の解明を目的として，肝細胞癌株4種（HLE，HLF，PLC/PRF/5，HuH7）において，通常酸素下もしくは低酸素環境下で培養を行い，低酸素下では増殖が抑制されるが，1細胞当たりのExosome分泌量は増加しており，低酸素培養下の肝癌細胞から分泌されるExosomeが血管内皮細胞（HuVEC）の管腔形成を促進することをすでに確認している。次に，Exosome内に内包されるmiRNAのうち，癌における血管新生に関連するmiR-21，miR-26a，miR-122，miR-146a，miR-155，miR-182の発現を検討したところ，miR-155の含有量が有意に増加していた。そこで，肝癌細胞から分泌されるmiR-155の血管新生における直接的な関与について，anti-miR-155を用いた阻害実験を行い，血管内皮細胞（HuVEC）の管腔形成能を評価した。HuH-7にanti-miR-155をtransfectionすることによって，低酸素培養下で誘導されるHuH-7自体のmiR-155発現量は抑制されて，通常酸素下の発現量と有意差を認めなくなった。同様に低酸素培養下のExosome内に含有されるmiR-155量も低下しており，このExosomeをHuVECに添加すると管腔形成が阻害され，通常酸素下と同程度であった。今後は，通常培養下および低酸素培養下で肝癌細胞もしくは血管内皮細胞より分泌されるエクソソームおよびanti-miR-155をtransfectionsした肝癌細胞株からのエクソソームを抽出し，トランスクリプトーム解析，microRNAアレイを行い標的分子を同定するとともに，切除標本の新鮮サンプルよりオルガノイドを作成し，腫瘍細胞由来のエクソソームを抽出することで，標的分子の発現を検討する予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason miR-155が肝細胞癌における血管新生促進および浸潤・転移に関与していることを見出すことができたが， miR-155の働きを，胆道癌，膵臓癌においても，がん関連線維芽細胞への作用を検証する予定にしている。エクソソーム内のmicroRNAを網羅的に解析することで標的分子同定を進めていく予定にしているが，まだ解析を行なえていないため，やや遅れていると判断する。
Strategy for Future Research Activity	胆道癌・膵癌とがん関連線維芽細胞についての実験系については，分担研究者の所属する施設において確立されているため，さらに共同研究を進める予定である。また，エクソソームをトランスクリプトーム解析，microRNAアレイを行い標的分子の同定を行うとともに，臨床サンプルを用いて検討する予定であるが，臨床サンプルの集積ができており，オルガノイド作成も予備実験にて可能となっているため，これらを用いて，研究を推進することが可能である。
Causes of Carryover	予定していたトランスクリプトーム解析およびmicroRNAアレイに提出しなかったために次年度使用額が生じた。次年度は，通常の細胞実験や臨床サンプル評価のための物品費に加えて，今年度実施できなかった遺伝子解析を行うため，次年度使用額が必要である。