胃分化型癌を抑制する糖転移酵素α4GnTの発現機構

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K09075
• Research Institution: Shinshu University
• Principal Investigator: 加藤 真良 信州大学, 学術研究院医学系, 助教 (70402104)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中山 淳 信州大学, 学術研究院医学系, 教授 (10221459)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 胃癌 / 胃型腺癌 / α4GnT / 遺伝子発現機構

Outline of Annual Research Achievements

α1,4-N-アセチルグルコサミン(αGlcNAc)は胃腺粘液に含まれる特殊な糖鎖構造であり、糖転移酵素α4GnTによってのみ合成される。α4GnT欠損マウスでは胃分化型癌が自然発症する。加えてヒト胃分化型癌ではαGlcNAcの発現が抑えられること、膵臓などの胃型腺癌で異所的に発現したαGlcNAcが、悪性度の進行に伴いその発現が抑えられることが分かってきている。本研究は、未だ不明であるα4GnTの発現機構に着目し、その遺伝子プロモーターや活性化因子、シグナル経路を調べることで、発癌機構の一端を明らかにすることを目的として行っている。既に見出したA4GNT遺伝子プロモーターに存在するエンハンサーとして知られる
CAAT boxに結合する転写因子の一つについて解析を進めたところ、A4GNT遺伝子が発現するNUGC4細胞を使ったルシフェラーゼ遺伝子レポーターアッセイによりCAAT boxの場所、その向きが遺伝子発現に必須であることが分かった。しかしながら、その結合転写因子の過剰発現はA4GNT遺伝子発現に何の効果もなく、またRNA干渉法によるその結合転写因子発現抑制によりむしろA4GNT遺伝子発現が促進されることが分かった。実際にヒト胃型腺癌において、αGlcNAcの発現が認められる部位ではその結合転写因子発現が抑えられ、αGlcNAcが消失した部位でその発現が促進されていた。これらのことにより、既に見出したA4GNT遺伝子プロモーター結合転写因子は抑制的に作用することが示唆され、遺伝子発現誘導に寄与する因子ではない可能性が強まった。この転写因子はホモダイマーやファミリータンパク質とのヘテロダイマーを形成して機能することが報告されており、現在そのファミリータンパク質の方にも着目して解析を進めている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

既に得られた実験結果より、A4GNT遺伝子プロモーター領域に転写因子が有意に結合する場所は2か所であり、それらの場所の塩基配列の特徴も加味すると、それぞれに転写因子であるHNF1タンパク質とEtsタンパク質が結合することが想定される。実際に結合が確認されたHNF1αは、解析を進めた結果、A4GNT遺伝子発現誘導に寄与しないことが示唆された。そのため、他のA4GNT発現誘導に寄与する、その部位に結合する因子の検討が必要になった。RT-PCR解析の結果から、A4GNT発現が認められる胃癌由来細胞株NUGC4では、HNF1αとβが同等に発現していることが確認されたため、HNF1βについてもA4GNT発現誘導への寄与について解析することにした。転写因子結合部位のDNA断片を使ったプルダウンアッセイ法では、非特異的な結合物の排除が困難であり、特異的結合物が見いだせていない。また、Etsタンパク質はファミリータンパク質の種類が多く、候補が絞りきれず、特異的抗体を使ってのA4GNTプロモーター領域に結合するEtsタンパク質の同定が困難である。

Strategy for Future Research Activity

①先ずはHNF1βがA4GNTプロモーターに結合し、遺伝子発現に寄与するか、ゲルシフトアッセイ、ルシフェラーゼ遺伝子レポーターアッセイやクロマチン免疫沈降法等で確認する。Etsタンパク質結合部位についても並行して結合タンパク質同定を試みるが、CAAT box付近を欠損させるとA4GNT遺伝子発現が著しく抑制されることから、まずはここの制御機構を重点的に解析する。
②HNF1βがA4GNT発現に寄与した場合、その活性化機序を、A4GNT遺伝子発現が認められるヒト胃未分化型癌由来細胞株NUGC4細胞を使って検討する。阻害剤などの化学処理、活性化型変異体の強制発現やRNAi法等を用い、ルシフェラーゼ遺伝子レポーターアッセイで確認する。HNF1αとの関係についても検討する。更に、その上流のシグナルについても検討する。結合タンパク質を免疫沈降法やプルダウンアッセイ法で見出し、質量分析法での同定も試みる。
③転写因子結合配列データベースの検索より、A4GNTプロモーターとの親和性が高い上位のEts蛋白質のNUGC4細胞における発現状況をRT-PCR法で確認し、発現が認められるものについて①と同様のことを行う。
④胃分化型癌においてα4GnTの発現が抑制される機構の解析を、A4GNT遺伝子発現が抑制されているヒト胃分化型癌由来細胞株AGS等も使って検討する。③までの解析で明らかになった機構が、AGS細胞ではどのようになっているかを比較検討し、胃分化型癌でA4GNT発現が抑えられる仕組みを見出す。癌組織におけるその発現を誘導するシグナルの解析も、ヒト癌組織検体を使った免疫組織化学的手法を用いて行う。これらによりA4GNT発現に着目した胃分化型癌や胃型腺癌発症の仕組みを明らかにする。

Causes of Carryover

研究進捗が遅くなっており、それに伴って予算未執行分が生じた。したがって次年度に予定通りの用途で予算未執行分も合わせて執行する予定である。