2020 Fiscal Year Research-status Report
Identification and function analyses of novel cancer-specific transfer RNA fragments in esophageal cancer
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20K09078
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
浜井 洋一 広島大学, 病院(医), 講師 (90423384)
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2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 食道癌 / Small RNA / Transfer RNA / 核酸医薬 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
食道癌の治療成績向上には、癌の浸潤・転移と治療感受性機構の解明、新規分子マーカーの同定、新規治療開発が急務である。我々は食道癌患者の癌組織と血中エクソソーム内の small ribonucleic acid (RNA) 解析を行い、その中に多くの transfer RNA 断片 (tRNA fragment：tRF) を確認した。また食道癌患者と健常者血清中の isoforms of micro RNA と mature micro RNAの発現を比較し、食道癌早期診断のための診断パネルを作成し報告した。(Ibuki Y, Hamai Y, et al. Circulating microRNA/isomiRs as novel biomarkers of esophageal squamous cell carcinoma. PLoS One. 2020;15:e0231116)
本研究では、低酸素環境で培養した食道癌細胞株と食道癌患者の血清を用いて、エクソソーム内の small RNA を網羅的に解析し、癌患者で特異的に発現し悪性度や治療効果、予後と相関するtRFを同定し機能解析を行う。
これまで我々は、食道扁平上皮癌細胞株を低酸素ワークステーションにおいて培養し、細胞増殖、HIF-1発現の測定を行い低酸素環境への適応を評価し、浸潤・遊走能、抗癌剤感受性の変化を確認した。また、この培養上清中のエクソソームと通常酸素環境下のエクソソームを回収し内包RNAを抽出。次世代シークエンサーを用いてsmall RNAの網羅的解析を行った。低酸素環境下において有意に発現が変化するmiRNAおよびtRFを抽出し、現在、これまで解析してきた食道癌患者の血清から同定されたtRFとの発現を比較・検討することで、臨床病理学的因子や化学・放射線療法の治療効果、予後と相関するtRFを選定している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
食道扁平上皮癌細胞株TE-1、TE-11、TE-14を低酸素ワークステーションにおいて培養し、細胞増殖、HIF-1発現の測定を行い低酸素環境への適応を評価。これらの細胞株の浸潤・遊走能、種々の抗癌剤感受性の変化を確認した。この培養上清に放出されたエクソソームと通常酸素環境下での培養上清のエクソソームをexosome isolation Kitにて回収し内包RNAを抽出。次世代シークエンサーを用いてsmall RNAの網羅的解析を行い、低酸素環境ストレス下において有意に発現が変化するmiRNAおよび tRF を抽出した。この結果と、これまで解析してきた食道癌患者の血清エクソソームで同定されたtRFと食道癌切除組織から抽出したRNAでのtRF発現と比較することで、癌組織に発現し、進行度や予後、化学・放射線療法の治療効果に関わり、治療過程で発現が変化する候補tRFを選定している。
当初の計画では、食道癌患者血清を用いて、上記の候補tRFを定量的RT-PCRにて再評価し、臨床病理学的因子や化学・放射線療法の治療効果、予後との相関を確認・検証し、その機能解析を行う予定であった。現在はこの前段階までしか研究を進められておらず、計画よりやや遅れていると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
特定された癌特異的tRFをプラスミドにより細胞株に導入しtRFの発現を上昇させる。またRNAインヒビターにより発現抑制細胞株も作製し使用する。これらの食道癌細胞株を用いて、以下の通り新規癌関連tRFの機能解析を行う予定である。
1.Cell invasion assay, Cell migration assayにて細胞浸潤・遊走能について比較検討する。
2.種々の抗癌剤の感受性についてMTT assay にて比較検討し、薬剤感受性については、複数の薬剤に対する耐性細胞株も作製し、tRF 発現の変化を解析する。
3.tRFのターゲット分子を予測し、ターゲット分子の上・下流の遺伝子と蛋白質発現の変化を解析する。
4.tRFに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドによる細胞機能（浸潤・遊走能、薬剤感受性とともにアポトーシス）の変化を解析する。
以上より、tRFが癌の悪性化と治療耐性にいかに関わっているか、新たな分子機構を解明し、分子マーカーとしての有用性と核酸医薬の治療標的としての可能性を評価する。
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| Causes of Carryover |
現在まで研究計画からやや遅れており、癌特異的tRFの機能解析まで進めていない。このため、本年度に使用する予定であったCell invasion assay, Cell migration assay、種々の抗癌剤についてのMTT assayができておらず、これらに使用予定であった本年度助成金を次年度に回すことになった。
次年度は癌特異的tRFの機能解析を開始する予定である。tRFをプラスミドにより細胞株に導入しtRFの発現を上昇させる。またRNAインヒビターにより発現抑制細胞株も作製し使用する。これらの食道癌細胞株を用いてtRFの機能解析を行う。このため今後は、Cell invasion assay, Cell migration assay、種々の抗癌剤の感受性についてはMTT assay、tRFターゲット分子の上・下流の遺伝子と蛋白質発現の変化を解析し、tRFに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドによる細胞機能（浸潤・遊走能、薬剤感受性とともにアポトーシス）の変化を解析する予定である。次年度使用額とともに翌年度分として請求した助成金を、細胞培養試薬、実験消耗薬剤・器具、各種アッセイキットのために使用する予定である。
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