マウスモデルを用いた免疫チェックポイント阻害剤の新たな治療抵抗メカニズムの解明

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K09160
• Research Institution: Gunma University
• Principal Investigator: 河谷 菜津子 群馬大学, 医学部附属病院, 医員 (80805557)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 矢島 俊樹 群馬大学, 大学院医学系研究科, 准教授 (20346852) ; 大瀧 容一 群馬大学, 医学部附属病院, 助教 (00625402) ; 中澤 世識 群馬大学, 医学部附属病院, 助教 (60791978)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 疲弊化CD8T細胞 / 免疫チェックポイント分子 / 腫瘍免疫

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、我々が独自に確立した抗原特異的疲弊化CD8T細胞を誘導するモデルを用いて、疲弊化に関与する、各免疫チェックポイント分子(PD-1,CTLA-4,LAD-3,TIM-3,TIGIT)の役割を解明し、有効な癌免疫療法の開発を目指す。
OVA257-264特異的T細胞レセプタートランスジェニックマウスであるOT-Iマウス（Ly5.1+）の脾臓からナイーブCD8T細胞を単離し、C57BL/6マウス（Ly5.2）に移入後、翌日移入したマウスに卵白アルブミン産生EL-4細胞（EG.7）を皮下接種し、腫瘍接種1－4週目の腫瘍局所、所属リンパ節、脾臓における抗原特異的CD8T細胞をVα2抗体とCD45.1抗体で検出した。2週目をピークにOT-I細胞が誘導され、その数は生体内の10～50倍程度まで誘導された。腫瘍接種後、1、2、3または4週目でTIL、リンパ節、脾臓におけるOT-I細胞のPD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGITの発現を経時的に解析すると、リンパ節で１週目からPD-1がほぼすべての細胞で誘導され、CFSEで検討するとその発現はクローン増殖に伴って上昇した。同時期にLAG-3、TIGITも発現誘導されたが、その頻度はそれぞれ30％程度と50％程度と一部の細胞のみ発現し、その発現もクローン増殖に伴って上昇した。2週目に入ると、PD-1、LAG-3、TIGHITは１週目と同程度で維持されていたが、新たにTIM-3の発現が上昇し、CTLA-4はTILのみで上昇し、その頻度はそれぞれ50％、30％程度であった。これらのことから誘導されるOT-Ｉ細胞は、免疫チェックポイント分子の発現がヘテロな細胞集団であることが明らかとなり、さらに各免疫チェックポイント分子は発現時期が異なることも明らかとなった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度の研究において、OT-I細胞における各免疫チェックポイント分子(PD-1,CTLA-4,LAD-3,TIM-3,TIGIT)の経時的変化を解析できた。同じ抗原を認識する細胞でありながら、その細胞における免疫チェックポイント分子の発現パターンが異なり、時間的にも違うことを明らかにできた。時間が経過するに従い、免疫チェックポイント分子の発現する数も増えさらなる疲弊化に関与している可能性が示せた。以上より、次年度はこの成果をもとに更なる研究がすすめられるので、全体を通して当初の研究計画に沿って進行できているため「概ね順調に進展している」と評価した。

Strategy for Future Research Activity

今後、誘導されたOT-Ｉ細胞において、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGITでそれぞれの免疫チェックポイント分子を発現する細胞分画の機能評価を行う。OT-I細胞のすべてでPD-1が発現していたが、各免疫チェックポイント分子は一部の細胞で発現しているのみであったので、その意義として機能の違いを評価する予定である。機能評価の指標として、各免疫チェックポイント分子が発現している細胞において、細胞傷害活性蛋白であるグランザイム発現を検討する。また、ペプチド刺激後のIFN-γ発現も検討し、免疫チェックポイント分子の発現パターンとIFN-γ産生細胞の相関を評価する。さらにCTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGITの発現で共発現している細胞を同定し、特に機能が低下している細胞分画を検討する。
さらに、このモデルにおいてCTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGITの中で、先の実験で機能低下している細胞分画で発現している免疫チェックポイント分子に対する抗体を投与し抗腫瘍効果が得られるか検討する。その抗体投与後、OT-Ｉ細胞の機能を評価するために、グランザイム発現とIＦＮ-γ産生を評価する。より有効な抗腫瘍効果が得られる投与時期、投与量のスケジュールも検討する。最も抗腫瘍効果が得られるスケジュールで、腫瘍接種後、1、2、3、4週目でTIL、リンパ節、脾臓細胞におけるOT-I細胞のPD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGITの発現を経時的にフローサイトメーターで解析する。さらにPD-1抗体とその免疫チェックポイント分子の併用し抗腫瘍効果を検討する。

Causes of Carryover

予定通り実験がすすんでいるが、実験に使用する抗体の一つが次年度の購入となり、次年度使用額が生じた。翌年度分として請求した助成金と合わせた使用計画に関しては、研究計画全体のスケジュールと内容が概ね順調に進展している為、予定通りの使用計画とした。