Crosstalk between HCN channels and hydrogen sulfide in the generation of neuropathic pain.

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K09254
• Research Institution: Iwate Medical University
• Principal Investigator: 駒切 洋 岩手医科大学, 医学部, 助教 (80405753)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 後根神経節 / 過分極活性化電流 / 硫化水素 / アデニル酸シクラーゼ / 神経因性疼痛 / HCNチャネル

Outline of Annual Research Achievements

神経因性疼痛の原因および治療のターゲットとして注目されてきた内因性硫化水素と過分極活性化陽イオンチャネル (HCNチャネル)の連関を調べ、神経因性疼痛の病態発生メカニズムについての新たな知見を獲得することが本研究の目的である。
成ラットの脊髄組織から後根神経節を採取し、酵素処理により後根神経節細胞を分離、培養を行い、神経細胞に対しパッチクランプ法を用いて過分極活性化陽イオン電流 (Ih)を測定した。硫化水素はアデニル酸シクラーゼを活性化し細胞内cAMP濃度を上昇させる作用が報告されている。そこで培養後根神経節細胞においてアデニル酸シクラーゼの活性化がIhの活性化の電位依存性を変化させるのかをアデニル酸シクラーゼの賦活薬であるフォルスコリンを用いて確認した。細胞内環境を人工的な細胞内液で完全に置換するconventional whole-cell voltage-clamp法ではIhの活性化の電位依存性に対するフォルスコリンの有意な効果は見られず、アデニル酸シクラーゼの基質であるATPの細胞内液中の濃度を増加させても同様だった。また硫化水素のドナーである硫化水素ナトリウム (NaHS)の作用も見られなかった。そこで細胞内の情報伝達系をより生理的な状態に保つ実験手法であるグラミシジンを用いた穿孔パッチ法による電流測定を行ったところ、フォルスコリンによるIhの活性化が観察された。フォルスコリンによるIhの活性化作用は一部の細胞では細胞内に直接添加したcAMPの最大作用を上回っていた。Ihの細胞内情報伝達系を介した活性調節を明らかにするにはグラミシジン穿孔パッチ法が有効であると判断し、現在この系を用いて硫化水素の効果を評価するために実験データを収集している。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初用いたconventional whole-cell voltage-clamp法ではIhの活性化に対するアデニル酸シクラーゼおよび硫化水素の作用を適切に評価できなかったため。

Strategy for Future Research Activity

グラミシジン穿孔パッチ法を用いてIhの活性化の電位依存性に対する硫化水素の効果とそのメカニズムを詳細に検討する。また、神経トレーサーおよびマーカーによるラベル、Ihを測定した細胞からのカプサイシン、イシリン感受性電流の確認を行い、測定した後根神経節細胞の機能的な性質を分類する。

Causes of Carryover

海外へ発注した電気生理学実験用消耗品 (ガラスキャピラリ)の納入遅れとオンライン開催となった学会の旅費が不要となったため。
2021年度は電気生理学実験の際に刺激物質による応答や細胞直径のみでなく神経細胞マーカーを使用した分類を行う。そのための蛍光標識試薬の購入に前年度未使用額を使用する。