New approach for the mechanisms of septic encephalopathy based on cyclophilin D signal transduction and mitochondrial permeabilty transition pore structure

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K09255
• Research Institution: Tokyo Medical University
• Principal Investigator: 内野 博之 東京医科大学, 医学部, 主任教授 (60266476)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 石田 裕介 東京医科大学, 医学部, 講師 (40805884) ; 柴田 勝一郎 東京医科大学, 医学部, 助教 (70869429)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: シクロフィリンD KOマウス / ミトコンドリア / マイトファゴソーム

Outline of Annual Research Achievements

ミトコンドリア選択的なオートファジーであるmitophagyの検証と役割の検討を主たる目的とした。SAE誘発における脳マイトファジー形成の検証とCypD情報伝達系のマイトファジー発現に果たす役割の解明について第8-10週令の雄性C57B6マウスのwild群、CypD KO群を用いてSAEモデルを作製し、モデル作製６、１８時間後（各時間・両群、各群のshamとも５匹ずつのマウスを使用）に4℃ ２％パラホルムアルデヒド＋2.5%グルタールアルデヒド添加0.1Mリン酸バッファー溶液で灌流固定する。大脳（視交叉より2mm後方）の冠状断面で２ｍｍの切片を切り出し、3%グルタールアルデヒド＋1%リン酸バッファー4酸化オスミウムにて固定後にエポン包埋し0.12mmで薄切切片を作成し、0.2%クエン酸鉛+1%酢酸ウランにて染色した後に走査電顕にてマイトファゴソーム形成の有無を解析を行った。抗LC3B抗体と抗p62抗体を用いたimmunoblottingを行い、デンシドメトリーにてLC3-II(脂質修飾型)/LC3-I比（マイトファゴソーム形成・量を反映）、p62の減衰スピード（分解能を反映）を評価し、SAE誘発・脳マイトファジー形成を検証・定量化し、CypD情報伝達系のマイトファジーに果たす役割を解明することも同時に行う予定とした。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

走査電顕にてマイトファゴソーム形成の有無を解析すべく、サンプル調整を行い電顕による薄切切片を作成したが、マイトファゴソーム形成を得ることができなかったため。抗LC3B抗体と抗p62抗体を用いたimmunoblottingを行い、デンシドメトリーにてLC3-II(脂質修飾型)/LC3-I比（マイトファゴソーム形成・量を反映）、p62の減衰スピード（分解能を反映）までは解析が進まなかったため。

Strategy for Future Research Activity

再度、走査電顕によるマイトファゴソームの検出を試みる予定である。抗LC3B抗体と抗p62抗体をいくつか試みてimmunoblottingを行い、デンシドメトリーにてLC3-II(脂質修飾型)/LC3-I比（マイトファゴソーム形成・量を反映）、p62の減衰スピード（分解能を反映）の解析を行う。

Causes of Carryover

研究計画の遂行が遅れたため、予算に次年度使用額が生じた。今回は、CLPモデルを用いて再度走査電顕にてマイトファゴソーム形成の有無を解析すべく、サンプル調整を行い、電顕による薄切切片を作成し、マイトファゴソーム形成を観察する。抗LC3B抗体と抗p62抗体を用いたimmunoblottingを行い、デンシドメトリーにてLC3-II(脂質修飾型)/LC3-I比（マイトファゴソーム形成・量を反映）、p62の減衰スピード（分解能を反映）の解析を行う予定である。