New approach for the mechanisms of septic encephalopathy based on cyclophilin D signal transduction and mitochondrial permeabilty transition pore structure

2023 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20K09255
• Research Institution: Tokyo Medical University
• Principal Investigator: 内野 博之 東京医科大学, 医学部, 主任教授 (60266476)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 石田 裕介 東京医科大学, 医学部, 講師 (40805884) [Withdrawn] ; 柴田 勝一郎 東京医科大学, 医学部, 助教 (70869429)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 敗血症 / ミトコンドリア / ミトファジー

Outline of Annual Research Achievements

ミトコンドリア選択的なオートファジーであるmitophagyの検証と役割の検討を主たる目的とした。SAE誘発における脳マイトファジー形成の検証とCypD情報伝達系のマイトファジー発現に果たす役割の解明について第8-10週令の雄性C57B6マウスのwild群、CypD KO群を用いてSAEモデルを作製し、モデル作製６、１８時間後（各時間・両群、各群のshamとも５匹ずつのマウスを使用）に4℃ ２％パラホルムアルデヒド＋2.5%グルタールアルデヒド添加0.1Mリン酸バッファー溶液で灌流固定する。大脳（視交叉より2mm後方）の冠状断面で２ｍｍの切片を切り出し、3%グルタールアルデヒド＋1%リン酸バッファー4酸化オスミウムにて固定後にエポン包埋し0.12mmで薄切切片を作成し、0.2%クエン酸鉛+1%酢酸ウランにて染色した後に走査電顕にてマイトファゴソーム形成の有無を解析を行った。抗LC3B抗体と抗p62抗体を用いたimmunoblottingを行い、デンシドメトリーにてLC3-II(脂質修飾型)/LC3-I比（マイトファゴソーム形成・量を反映）、p62の減衰スピード（分解能を反映）を評価し、SAE誘発・脳マイトファジー形成を検証・定量化し、CypD情報伝達系のマイトファジーに果たす役割を解明することも同時に行う予定としたが、うまく定量化できなかった。再度、走査電顕によるマイトファゴソームの検出を試みたが、抗LC3B抗体と抗p62抗体を用いたimmunoblottingを行うための適切な抗体を入手することができず、デンシドメトリーにてLC3-II(脂質修飾型)/LC3-I比（マイトファゴソーム形成・量を反映）、p62の減衰スピード（分解能を反映）までは解析が進まなかった。