2020 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of neuroprotection and neural axon regeneration mechanism by PACAP
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20K09262
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
柴藤 淳子 星薬科大学, 先端生命科学研究所, 寄附講座等客員助教 (10611121)
塩田 清二 星薬科大学, 先端生命科学研究所, 教授 (80102375)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | pacap |
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| Outline of Annual Research Achievements |
神経ペプチドPACAP（Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide：下垂体アデニル酸シクラーゼ性化ポリペプチド）による軸索再生に関与する因子の探索を行うことでPACAPを用いた新規治療薬や再生医療の開発への貢献を目指す。本研究ではIn vitro創傷アッセイでのオミックス解析によりPACAPによる軸索形成や軸索損傷回復に関与するシグナル経路を明らかにすることを目的とした。
今年度は①損傷アッセイin vitroモデル作成、②PC12細胞を用いたPACAPによる突起伸長関与因子およびシグナル経路の検討を行った。②のPC12細胞を用いた実験ではマイクロアレイおよびショットガンプロテオーム解析のためのサンプリング（PACAP添加後15、30、60、120分）を行いデータが得られた。マイクロアレイに関しては解析ソフト等使用してデータ解析を進めた。同時にショットガンプロテオームのデータに関しても解析を進め、遺伝子とタンパク質発現の結果を統合的に解析することでPACAPによる突起伸長関与因子の同定を目指している。
一方で①の実験では損傷アッセイに使用する予定だったシリコーン樹脂製チャンバーに対して目的のコーティング剤が合わず、突起伸長実験の再現性に問題が生じた。よって96ウェルあるいはディッシュを用いた損傷アッセイin vitroモデル作成に関しては次年度に再検討を行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
損傷アッセイin vitroモデルの作成において、チャンバーXonaChipを使用した実験ではコーティング剤が合わないためなのか、細胞接着が弱く、軸索伸長の再現性に問題が生じた。よって今後は96ウェルプレートを使用した損傷アッセイin vitroモデルの検討を次年度に行う必要が生じた。
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| Strategy for Future Research Activity |
①損傷アッセイin vitroモデル作成の再検討
96ウェルプレートなどを使用し、目的のコーティング剤で処理したのちにPC12細胞や初代神経細胞を培養する。スクラッチはブレードで作成する。その後PACAP添加と無添加での軸索伸長の確認は軸索マーカ（Tau抗体など）による標識して蛍光顕微鏡で観察することで評価する。
②マイクロアレイによる遺伝子発現解析
PC12細胞や初代神経培養細胞を用い、クラッチ処理した後にPACAP添加、無添加の条件でマイクロアレイ解析を行う。DNAマイクロアレイにより得られた結果から、PACAPにより遺伝子発現量に変化があった遺伝子をリスト化する。リスト化された遺伝子群のオントロジー解析、パスウェイ解析などを行うことで、PACAPによって変動した遺伝子の生物学的機能やシグナル経路を同定する。
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