2020 Fiscal Year Research-status Report
虚血に対する神経ペプチドPACAPの神経保護作用の分子機構
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20K09316
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| Research Institution | Hoshi University |
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Principal Investigator |
平林 敬浩 星薬科大学, 先端生命科学研究所, 寄附講座等講師 (40297015)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
竹ノ谷 文子 星薬科大学, 薬学部, 准教授 (30234412)
RAKWAL RANDEEP 筑波大学, 体育系, 教授 (70590850)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | PACAP / 神経細胞死防御 / 虚血 / PAC1-R / 遺伝子ノックアウトマウス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド (PACAP)は主に神経組織で発現しており、生体内で多様な機能を担っている。近年、脳虚血モデル動物を用いた研究結果から、PACAPはその受容体分子を介した遅発性神経細胞死抑制作用を持ち、傷害を受けた神経の機能を回復することが明らかになっているが、その詳細な分子制御機構は明らかになっていない。そこで、本研究では、脳虚血によって引き起こされる神経細胞死に対するPACAPの細胞死抑制作用の分子調節機構の解明を目的とし、受容体遺伝子ノックアウトマウス、特異的阻害剤等を用いた研究を行い、将来的に虚血性神経細胞死を防御することが可能な新規予防治療薬の開発を目指す。
本研究ではPACAPの神経細胞死抑制作用の分子機構の詳細を明らかにすることを目的として、in vitroで動物個体での虚血を再現できるニューロン・グリア共培養系での低酸素低グルコース負荷（Oxygen Glucose. Deprivation：OGD）処置を行うが、当該年度は、ニューロン・グリア共培養系の確立およびin vivo実験を行う前の予備実験を行った。その結果、OGD処置に対するPACAPの神経細胞死抑制作用はPACAP3種の受容体 (PAC1-R, VPAC1-R, VPAC2-R)の1つであるPAC1-Rを介していることが明らかになった。また、in vivoでの実験に用いることを目的として、PACAP受容体の中で神経細胞死抑制作用に関与していることが示唆されているPAC1-R遺伝子ノックアウトマウスをCRISPR/Cas9系を用いて作製した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究ではPACAPの神経細胞死抑制作用の分子機構を解析することを目的として、in vitroで動物個体での虚血を再現できるニューロン・グリア共培養系での低酸素低グルコース負荷（Oxygen Glucose. Deprivation：OGD）処置を行うが、当該年度は、ニューロン・グリア共培養系の確立およびin vivo実験に際しての予備実験を行った。ニューロン・グリア共培養細胞に対し、OGD処置を行い、その際の生細胞数をNeuN抗体による免疫細胞化学的手法で解析したところ、生細胞数は約30%に減少した。このOGD処置の際にPACAPを添加すると生細胞数は約90%に回復した。また、PACAPと共にPACAP受容体の1種であるPAC1-Rのアンタゴニストを添加した際には、PACAPによる細胞死の抑制は認められなくなった。この結果はPACAPの神経細胞保護作用にはPAC1-Rが関与しているという、脳虚血モデル動物での実験結果と一致していた。以上のことからニューロン・グリア共培養細胞はin vivoの結果を反映する系であることが明らかになったため、今後更なる解析を続けていく。
また、PAC1-R遺伝子ノックアウトマウスしたところ、作製したヘテロマウスを交配して得られたホモマウスの90%以上は生後まもなく死亡したが、生存したホモマウスは外見に異常な点は認められず、また雌雄共に交配することが可能であった。現在、ホモマウスに見られる死亡の原因について解析を行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は本年度に確立することが出来たニューロン・グリア共培養系で得られた知見を基にし、虚血モデルマウスに対して各種シグナル伝達分子の阻害薬等を用いた実験を行い、動物個体レベルで確認する。脳虚血モデルに対するPACAPの神経細胞死抑制作用についてはTTC（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride）染色を行い評価する。このin vivo実験を行うことで、虚血に対するPACAPの神経保護作用の分子機構、さらには神経保護作用を有する治療薬開発につながる新たな標的分子の発見が出来ることが期待できる。
また、本年度に作成したPAC1-Rノックアウトマウスを用いたin vivo実験も併せて進めていく予定であるが、同遺伝子ノックアウトマウスでは、ホモマウスの多くは生後まもなく死亡してしまうこと、また将来的な活用を考慮してCre発現依存的に遺伝子をノックアウトできるようにCRISPR/Cas9系を用いてloxP配列を挿入したPAC1-R遺伝子コンディショナルノックアウトマウスの作製も計画している。
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| Causes of Carryover |
当初、購入を予定していた、実験動物の購入費が少なく済んだため。また新型コロナ禍による学会の中止等で旅費が不要であった。これらの費用は次年度以降に計画しているPAC1-R遺伝子コンディショナルノックアウトマウス作製の費用に充てる。
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[Journal Article] Attenuation of relaxing response induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide in bronchial smooth muscle of experimental asthma.2020
Author(s)
Chiba Y, Ueda C, Kohno N, Yamashita M, Miyakawa Y, Ando Y, Suto W, Hirabayashi T, Takenoya F, Takasaki I, Kamei J, Sakai H, Shioda S.
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Journal Title
Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.
Volume: 319
Pages: L786-L793
DOI
Peer Reviewed
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