2022 Fiscal Year Research-status Report
虚血に対する神経ペプチドPACAPの神経保護作用の分子機構
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20K09316
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| Research Institution | 湘南医療大学 |
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Principal Investigator |
平林 敬浩 湘南医療大学, 臨床医学研究所, 研究員 (40297015)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
竹ノ谷 文子 星薬科大学, 薬学部, 准教授 (30234412)
RAKWAL RANDEEP 筑波大学, 体育系, 教授 (70590850)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | PACAP / PAC1受容体 / 神経細胞死防御 / 虚血 / 神経前駆細胞 / 遺伝子ノックアウトマウス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド (Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide, PACAP)は主に神経組織で発現しており、生体内では下垂体ホルモン分泌のほか、アドレナリン分泌、インシュリン分泌、涙液・汗・唾液分泌促進作用などの多様な機能を担っている。近年、我々は脳虚血・脳梗塞モデル、脊髄損傷モデルといった神経傷害モデル動物を用いた研究を行い、PACAPはその3種の受容体 (PAC1-R, VPAC1-R, VPAC2-R)を介して神経細胞死抑制作用を有することを明らかにしてきたが、その詳細な分子制御機構は未解明な点が多い。そこで本研究では脳虚血によって引き起こされる神経細胞死に対するPACAPの抑制作用における分子機構を明らかにすることを目的としてPACAP受容体遺伝子ノックアウトマウスを作製し、同マウスから単離した神経細胞および同マウスを用いた解析を行い将来的にPACAP作用を応用した虚血性神経細胞死を防御することが可能な新規予防治療薬の開発を目指す。
当該年度は野生型マウス脳から単離した神経細胞に虚血状態を模した神経細胞死を誘導した際のPACAPによる細胞死抑制作用について受容体アンタゴニストを用いて検討すると共に、PACAP受容体遺伝子ノックアウトマウスの脳から単離した神経前駆細胞を用いて同様の解析を行い、同作用におけるPACAP受容体を同定した。また、PACAPによる神経細胞死抑制機構の詳細を明らかにするためにDNAarrayを用いた解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
申請者は2021年4月に湘南医療大学へ異動したが、当該年度においても研究施設、特に動物飼育施設が十分に稼働していなかったため、当初予定していた多数の動物を用いた実験等をほとんど行うことができなかった。 そのため動物個体を対象にした実験において遅れが生じており、現在までは主に培養細胞に対する解析が中心となっている。
当該年度は、in vitroで動物個体での虚血による神経細胞死を再現できるニューロン・グリア共培養系を用いた予備実験を行った。マウス脳より単離したニューロン・グリア共培養細胞に対し、低酸素低グルコース負荷（Oxygen Glucose. Deprivation：OGD）処置を行ったところ、生細胞数は大きく減少した。このOGD処置の際にPACAPを添加すると生細胞数は回復したが、PACAPと共にPACAP受容体の1種であるPAC1-Rのアンタゴニストを添加した際には、PACAPによる細胞死の抑制は認められなくなった。また、野生型マウス、およびPAC1-R遺伝子ノックアウト (PAC1-R KO)マウスから単離した神経前駆細胞に対して同様の処置を行った。その結果、野生型マウス由来神経前駆細胞ではPACAP添加によりOGD処置による細胞死が抑制されたが、PAC1-R KOマウス由来神経前駆細胞ではPACAPを添加してもOGD処置による細胞死は抑制できなかった。これらの結果から、PACAPの神経細胞死抑制作用にはPAC1-Rが関与していることが明らかになった。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度までに行ったin vitro実験で得られた結果から、PACAPの神経細胞死抑制作用に関与しているPACAP受容体を同定することが出来た。
今後は虚血処置を施したマウスに対して各種シグナル伝達分子の阻害薬等を用いた実験を行い、PACAPによる神経細胞死抑制機構を動物個体レベルで解析する。このin vivo実験を行うことで、虚血に対するPACAPの神経保護作用の分子機構、さらには神経保護作用を有する治療薬開発につながる新たな標的分子の発見が出来ることが期待できる。
また、同時に野生型マウス、およびPAC1-R遺伝子ノックアウトマウスから単離した神経細胞をODG処置しPACAPを添加した際の遺伝子発現プロファイルをDNAarray解析して詳細な分子機構を明らかにする予定である
また、本研究課題にて作製したPAC1受容体遺伝子ノックアウトマウスのヘテロ欠損マウス同士を交配したところ、PAC1受容体ホモ欠損マウス出生数はメンデル比に比べて少ない傾向が認められた。このことはPAC1受容体遺伝子の欠損は胎生致死、あるいは生後まもなくの死亡を引き起こす傾向がある可能性を示唆しており、今後の動物個体を用いた解析が困難になることが予想される。また、将来的な研究の展開を考慮してCre発現依存的に遺伝子をノックアウトできるようにCRISPR/Cas9系を用いてloxP配列を挿入したPAC1受容体遺伝子コンディショナルノックアウトマウスの 作製を計画している。さらに、本研究を進めることでPACAPによる神経細胞死抑制作用においてPAC1受容体の下流で寄与する分子を同定した際にはその遺伝子についても遺伝子ノックアウトマウスを作製する予定である。
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| Causes of Carryover |
申請者は2021年4月に星薬科大学から湘南医療大学へ異動したが、当該年度においても研究施設、特に動物飼育施設が稼働していなかったため、当初予定していた動物実験等をほとんど行うことができなかった。そのため、当初購入を予定していた実験動物や試薬類の購入費が少なくなった。また新型コロナ禍により、当初参加を予定していた学会の中止、あるいはオンライン開催への変更に伴い参加費、旅費が一部不要となったことから次年度使用額が生じた。これらの費用は次年度以降に計画しているin vivo実験、およびPAC1-R遺伝子コンディショナルノックアウトマウス作製の費用等に充てる。
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