2021 Fiscal Year Research-status Report
神経膠芽腫において代謝経路再編成が細胞増殖や治療抵抗性に与える機序の解明
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20K09329
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
渡邉 孝 宮崎大学, 医学部, 講師 (90573337)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
水口 麻子 宮崎大学, 安全衛生保健センター, 講師 (00647472)
横上 聖貴 宮崎大学, 医学部, 准教授 (40284856)
山下 真治 宮崎大学, 医学部, 助教 (40468046)
竹島 秀雄 宮崎大学, 医学部, 教授 (70244134)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 神経膠芽腫 / 腫瘍内不均一性 / 表現型可塑性 / 上皮間葉転換 / 光線力学診断 / 血管新生 / 代謝回路再編成 / エピジェネティクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、メチオニン代謝経路の変化が、神経膠芽腫の腫瘍内不均一性や表現型可塑性に与える影響について検討した。当施設で樹立した神経膠芽腫幹細胞株を用いて、培養液からメチオニンを除去することによる遺伝子発現の変化を解明するため、Microarrayによる網羅的遺伝子発現解析を行った。Gene Set Enrichment Analysis（GSEA）により、S-adenosylmethionine dependent methyltransferase activity 関連の遺伝子発現や上皮間葉転換に関与する遺伝子発現に変化が認められることが判明したため、メチル化に関与する遺伝子発現と血管新生に関与する遺伝子発現の変化をRT-PCRで確認した。更に、Reduced representation bisulfite sequencingを用いたDNAメチル化の網羅的解析を行い、genome-wide DNA hypomethylationとヘム合成経路に関与する遺伝子や血管新生に関与する遺伝子の特異的遺伝子領域でのメチル化の変化が認められた。RT-PCRでヘム合成経路に関与する遺伝子発現の変化を確認し、これらの変化は経時的に変化し、可逆性であった。5-ALAにより誘導されるPpIXの蛍光強度の変化をflow cytometryで解析し、蛍光強度が低下することが判明した。更に血管新生に関与する遺伝子に発現をRT-PCRで確認した。今回の解析結果から、メチオニン代謝経路の再編成により、神経膠芽腫細胞の遺伝子発現の変化、DNAメチル化によるエピジェネティックな変化が誘導され、これらの変化が腫瘍内不均一性や表現型可塑性に関与していることが示唆された。現在、論文作成中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでの実験により、1) 神経膠芽腫幹細胞株の樹立、Clonogenic assay、タイムラプス動画撮影、2) マイクロアレイを用いた遺伝子発現解析,Gene Set Enrichment Analysis、 3) RRBSを用いたDNAメチル化の網羅的解析、4）RT-PCR、flow cytometryでの検証実験、5）標的遺伝子のプロモーターアッセイまで進んでおり、現在解析したデータを追加補足して、論文作成を行っている段階であり、概ね順調と考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究により、マイクロアレイを用いたGene Set Enrichment Analysis (GSEA)解析、 RRBSを用いたDNAメチル化解析により、メチオニン除去によって誘発される遺伝子発現の変化、エピジェネティックな変化について網羅的に解析を行ってきた。その結果、proneural-mesenchymal transition（上皮間葉転換）に関与する遺伝子発現に変化をきたすことが判明し、Stem cell marker(PROM1, OLIG2, FOXM1)が減少することが判明した。これまで、網羅的DNAメチル化解析で得られたメチル化プロファイルの情報をもとに分類したメチル化のパターンを判別するアルゴリズムを用いて、メチオニン代謝経路を起点とした上皮間葉転換のドライバー遺伝子を同定し、特異的にメチル化された部位について、転写因子および histone markの関与について解析してきた。現在は、DNA メチル化のみならず、遺伝子発現修飾機構の解明のため、網羅的miRNA 解析を行って、non-coding RNA についても解析を進めており、これに引き続き、プロモーター、エンハンサーでの候補部位をクローニングし、点変異を導入することで、メチル化によって遺伝子発現が変化する部位を同定する方針である。
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