Construction of the conditional knock out mouse which is specifically controlled endothelial cell in mouse brain

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K09376
• Research Institution: Meiji Pharmaceutical University
• Principal Investigator: 望月 靖子 明治薬科大学, 薬学部, 講師 (20386452)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: AQP11 / コンディショナルノックアウトマウス / アクアポリン / 脳

Outline of Annual Research Achievements

水チャネルとしての機能をもつアクアポリン（AQP）は、哺乳類においてAQP0からAQP12までの13種類が発現している。これらは身体中に分布されており、成体の機能を維持するには、いかに水が必要であるかが理解できる。マウスにおいても同様の遺伝子ファミリーであるが、中でもAQP11は胎児期から脳、腎、胸腺をはじめとする主要組織で発現していることを示してきた。しかしながら、AQPは身体中に発現しているにもかかわらず、AQP11の機能は完全に明らかにできていない。これまでもAQP11欠損（KO）マウスが作成されており、その作成方法は従来汎用されていたcre-loxPシステムを用いられていた。このAQP11欠損マウスの表現型は多発性嚢胞腎により生後１ヶ月以内に死亡してしまうので、全身のAQP11の形態変化や役割を明らかにするためには大きな障害となる。そこで、この問題を解決するためには脳でのみ得意的にAQP11の発現を欠損させたコンディショナルノックアウト（KO）マウスを作成することが必要である。このモデルにより幼若児の多発性嚢胞腎の進行に影響されずに脳のみでのAQP11の役割を明らかにすることが本研究の目的である。これにより、AQP11を欠損させた脳の表現型を明らかにすることのみならず、従来型のAQP11KOマウスで確認できた表現型が本来のAQP11欠損によるものなのか、初期に発生した嚢胞腎が影響となり他組織へ影響したものなのかも明らかにすることができる。さらには、コンディショナルKOマウスを用いて、脳梗塞モデルマウスを作成し、これまでにも申請者が取り掛かっている脳浮腫の制御とAQP11の関与を明らかにすることで、これまでとは異なる視点から脳浮腫や脳梗塞への治療へ応用できる基礎的な知見を積み重ねる。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

AQP11を特定の部位で欠損させるマウスを作成することが目的であり、昨年度は脳のどの部位に一番局在しているか、さらに脳血管内皮細胞で発現している遺伝子を選択することから開始した。実際に脳血管内皮細胞で発現している遺伝子は他の部位でも発現していると思われるものもあり、さらにはその遺伝子を選択することで発生段階に影響を及ぼす可能性もあり、コロナ禍で学内の仕事が増したこともあり時間を要している。昨年度までコンディショナルKOマウスの作成にP糖タンパク質MDR1（multidrug resistance protein 1）を候補にして検討してきたが、従来型のAQP11KOマウスの脳ではどのような発現の変化が生じるか、今後のコンディショナルKOマウスの参考に検討した。その結果、形態的には大きな問題はないと思われる。また、これまでに脳組織切片の免疫染色ではAQP11は血管内皮細胞の細胞膜に発現していることを示したが、今年度は脳血管内皮細胞モデル細胞である条件不死化細胞TM-BBB内での発現部位を特定することも試みた。培養細胞では成体の脳の血管内皮細胞と異なる性質もあるので解釈は難しいが、TM-BBBでは、AQP11は細胞質に顕著に、細胞膜にも発現していること、核にもわずかに発現していることをウエスタンブロットにて明らかにした。全体的な進捗はは遅れているが、明確にしてから進むべき点も明らかとなってきており、総合的には問題ないと思われる。

Strategy for Future Research Activity

進捗状況でも記載したAQP11が脳の血管内皮細胞（TM-BBB）の無刺激および細胞内外の極性のない環境で、AQP11は細胞質をメインに細胞膜に発現していることを明らかにした。これをもとにコンディショナルKOマウス作成時に対象とする遺伝子を再度検討し直し、マウスの調製をしていく予定である。これまで候補にしていたMDR1についても同時に進めていく予定である。さらには、脳血管内皮細胞だけでなく、脳内のどの部位のどの細胞（血管内皮細胞、グリア細胞）にAQP11の発現が多いのか、浸透圧を変化させるような負荷試験と共に検討予定である。

Causes of Carryover

コンディショナルノックアウトマウスの作成前に確認すべきことが増え、マウス作成が遅れている。予定通り使用する予定である。