アルギン酸包埋ヒト間葉系幹細胞関節内注射による変形性関節症疾患修飾薬の開発

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K09411
• Research Institution: Shimane University
• Principal Investigator: 内尾 祐司 島根大学, 学術研究院医学・看護学系, 教授 (20223547)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松崎 有未 島根大学, 学術研究院医学・看護学系, 教授 (50338183)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 変形性関節症 / アルギン酸ゲル / REC細胞

Outline of Annual Research Achievements

今年度は、ⅰ）アルギン酸ゲル包埋RECの作製、最適化を松崎が担当して、高純度間葉系幹細胞(REC)の調製を行った。ヒト骨髄細胞（human bone marrow cells: AllCells）よりRECを分離し、半透明膜を用いた2相式培養シャーレに片方を、炎症性サイトカインで（IL-1,TNFα）刺激したウサギ軟骨細胞あるいはiiで作製したウサギOA軟骨細胞、他方をRECとし、2週間供培養を行って、軟骨細胞およびRECの遺伝子発現の変化をPCR解析中である。また、培養液中の細胞外マトリックス（コラーゲン、GAG）をELIASAで定量し、これによってアルギン酸ゲルに包埋する際の最適なアルギン酸の濃度や、RECの細胞数などを検討している。
一方、ⅱ）アルギン酸ゲル包埋RECの動物OAモデルを用いた有効性検証を内尾および多久和が担当した。①高純度間葉系幹細胞(REC)の調製：ヒト骨髄細胞（human bone marrow cells: AllCells）よりRECを分離し、i)で確認した至適条件のアルギン酸ゲル包埋RECの調製した。②日本白色家兎の膝蓋骨内側より切開して関節内にアプローチし、前十字靱帯切離ACLTを行ってOAモデルを作製した。手術実施4週間後に、以下の4通りの内容 (0.3ml) を投与した。(a)アルギン酸ゲル包埋REC（アルギン酸ゲル+REC群）(b)アルギン酸ゲル単独（アルギン酸ゲル群）(c)REC単独（REC群）(d)生理食塩水（生食群）。その後、④疼痛評価を行い、膝関節内の肉眼による評価を行った後に両膝関節を取り出し軟骨変性部の組織学的評価を両群に行っている。また、⑤免疫染色・RECの残存評価や⑥炎症反応の評価を行っている。以上からアルギン酸包埋RECの関節内投与法のOA進行抑制に対する効果を形態学的、組織学的に現在、検討している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

1）アルギン酸ゲル包埋RECの作製、最適化およびⅱ）アルギン酸ゲル包埋RECの動物OAモデルを用いた有効性検証でも、方法論は確立した。
現在、その最適方法の探索と検証に入っているから。

Strategy for Future Research Activity

上記方法の移植時期、移植細胞数、移植方法などの最適化を行い、臨床研究に移行するために必要な要素技術を蓄積する。

Causes of Carryover

前年度の実験を引き続き行い、至適細胞数や至適投与回数を検討する予定である。ⅰ）アルギン酸ゲル包埋RECの作製、最適化（松崎が担当する）RECの作製・管理：健常若年男性の骨髄腋を材料に、RECをアルギン酸に包埋する際の最適なアルギン酸の濃度や、RECの細胞数などをin vitroでの実験で検証し決定する予定である。また、ⅱ）アルギン酸ゲル包埋RECの動物OAモデルを用いた有効性検証（内尾、多久和が担当する）。前年度の実験を引き続き行い、DMOADとしての至適条件を検索する予定である。