2021 Fiscal Year Research-status Report
ユーイング肉腫におけるマイクロRNAとDNA修復機構の治療抵抗性獲得への関与
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20K09414
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| Research Institution | Oita University |
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Principal Investigator |
河野 正典 大分大学, 医学部, 助教 (30571773)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田仲 和宏 大分大学, 医学部, 准教授 (10274458)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | Ewing肉腫 / 遺伝子修復因子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は予備的実験により、特異的融合遺伝子をKDしたEwing肉腫細胞におけるmiRNAおよびmRNAの発現変化を観察し、EWS-Fli1の影響を網羅的に把握している。本研究は、それらの遺伝子を標的とするmiRNAの発現異常を明らかし、DSB修復機構の亢進が特異的融合遺伝子の支配下にあることを示すことで、Ewing肉腫における治療抵抗性獲得のメカニズム解明と新たな治療戦略の展開へとつなげることを目的としている。修復因子のmRNAを標的とするmiRNA
を抽出する。その中でも特にsiRNAによるEWS-Fli1 KDで上昇するmiRNAを選定した。またEwing肉腫細胞株に対し、抽出したmiRNAのmimic oligoを導入後、目的とする修復因子の遺伝子発現が低下したことをmRNAおよび蛋白レベルで実証する。同様にsiRNA導入後、EWS-Fli1の遺伝子発現が低下したことを確認した。作成した細胞株群に抗がん剤投与および放射線照射を行った後、DSBが増減するかパルスフィールドゲル電気泳動にて評価する。同時に細胞増殖、アポトーシス誘導に関し検証を行う。Mimic oligoおよびsiRNA導入後の細胞株ではDSB発生頻度が上昇し、細胞増殖の抑制とアポトーシス誘導が増加していた。ヌードマウスにmimic oligoおよびsiRNA処理した腫瘍細胞株を移植し、in vivoにおいての抗がん剤治療を行い腫瘍増殖に変化があるか観察する。同時に増殖能および転移能の変化について検証中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
修復因子のmRNAを標的とするmiRNAを抽出し、その中で特にsiRNAによるEWS-Fli1 KDで上昇するmiRNAを選定できた。またEwing肉腫細胞株に対し、抽出したmiRNAのmimic oligoを導入後、目的とする修復因子の遺伝子発現が低下したことをmRNAおよび蛋白レベルで実証した。同様にsiRNA導入後、EWS-Fli1の遺伝子発現が低下したことを確認した。作成した細胞株群に抗がん剤投与および放射線照射を行った後、DSBが増減するかパルスフィールドゲル電気泳動にて評価できている。現在、修復因子mRNAを標的とするmiRNA mimic (mirVana miRNA mimic, Life Tech)を導入後、RT-PCRおよびウェスタンブロット法による標的mRNAおよび蛋白の発現を確認しHR, NHEJの各因子についてこれを標的とするmimic oligoを導入しパルスフィールド電気泳動（Bio-Rad）でDSBが誘導されていることを確認できる段階まで進んでいる。放射線照射後に活性化する因子の定量は当初再現性が得られなかったが照射前段階における培養条件のより厳密な管理と照射後にできるだけはやく培養にに戻して注意することで結果が安定してきた。使用する抗がん剤に関しても溶解後にできるだけはやく使用することで薬剤活性が低下しないことが重要であることも確認できた。上記の内容を再現性を持って実証するところまで進んでおり、概ね順調であると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度はFocus assay により、mimic oligoと融合遺伝子に対するsiRNA処理後に細胞につ
いてHR,NHEJの修復因子の発現を調べる。機能の指標としてHRはRad51, NHEJは53BP1を蛍光標識しfociをカウントすると同時にMimic oligoおよびsiRNAを導入後の細胞にDSBを誘発する抗がん剤トポイソメラーゼⅡ阻害剤を投与し、その後のDSB修復機能を評価する。Mimic oligoおよびsiRNAを導入後の細胞をマウス (BALB/c nu/nu)の臀部に腫瘍を移植し腫瘍形成後、トポイソメラーゼⅡ阻害剤を腹腔内投与し腫瘍形成能の変化を評価することで我々の仮説が生体でも同様の結果が得られるか評価が必要である。
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| Causes of Carryover |
細胞株を用いた検証において多くの群間比較やアッセイ系を組んだうえで染色体切断を修復する薬剤の指摘濃度を設定する予定であったが、予定よりも早期にアッセイ系を組むことが可能となったため、次年度使用額が生じた。今後は、本実験テーマである修復機構解明の実験や新型コロナウイルス感染症の状況等を見極めながら学会等への参加を考えているため、次年度使用額についてはそれらに使用する予定である。
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Research Products
(4 results)
