線維芽細胞増殖因子誘引フィブロインを用いて作製する移植用細胞シートの開発

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K09442
• Research Institution: Toho University
• Principal Investigator: 中川 晃一 東邦大学, 医学部, 教授 (30400823)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 赤津 頼一 東邦大学, 医学部, 講師 (20795190) ; 玉田 靖 信州大学, 学術研究院繊維学系, 教授 (70370666)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 軟骨再生 / 滑膜細胞 / フィブロイン / 線維芽細胞増殖因子

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、遺伝子組換えカイコより精製した線維芽細胞増殖因子2（Fibroblast growth factor2, 以下FGF2）誘引フィブロインを利用し、より層の厚い移植用ヒト滑膜細胞シートを作製することを目的としている。令和2年度は、ヒト手術検体より採取し分離した滑膜細胞またはヒト骨髄由間葉系幹細胞（不死化細胞株UE6E7-16）をFGF2誘引フィブロインスポンジ上に播種して細胞シートを作製し、細胞増殖能、組織像についてWild-typeフィブロインと比較検討した。細胞数、WST-1 assay、DNA量ともにFGF2誘引フィブロイン群で有意に高値を示し、細胞増殖効果が確認された。しかしながら、ヒト滑膜細胞では細胞シートの厚さに関しては個体差が大きく、十分な細胞層が得られないものもいくつか存在した。そこで、令和3年度は、安定した細胞層の得られるUE6E7-16を主に用いて、細胞シートから軟骨分化誘導を行うこととした。フィブロインスポンジ上に細胞を播種して12時間静置後に、10 %FBSおよび0.2 mM Asc2-P を添加した DMEM/F12 培地にて培養し、培養開始後１週目から200 ng/mlのrhBMP2を添加した軟骨分化誘導培地に変更してさらに2週間培養した。組織学的検討として、HE、アルシャンブルーによる染色と抗S100蛋白抗体および抗II型コラーゲン抗体を用いた免疫染色を行った。FGF2誘引フィブロイン群では、厚い細胞層が得られたが、アルシャンブルーでの染色性がやや低下し、抗S100蛋白抗体による免疫染色での陽性細胞数が低下する傾向が認められた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

令和3年度は安定した細胞層の得られるヒト骨髄由間葉系幹細胞（不死化細胞株UE6E7-16）を主に用いて、FGF2誘引フィブロインで作製した細胞シートから軟骨分化誘導を行った。1 million /discでフィブロインスポンジ上に細胞を播種して１週間培養後、200 ng/mlのrhBMP2を添加した軟骨分化誘導培地（DMEM high glucose, 1% ITS mix, 160μg/ml sodium pyruvate, 100 ng/ml dexamethasone, 0.2 mM Asc2-P, 10ng/ml TGF beta-3 ）に変更してさらに2週間培養した。組織学的検討として、HE、アルシャンブルーによる染色と抗S100蛋白抗体および抗II型コラーゲン抗体を用いた免疫染色を行った。その結果、FGF2誘引フィブロイン群では、アルシャンブルーでの染色性がやや低下し、抗S100蛋白抗体による免疫染色での陽性細胞数が低下する傾向が認められた。ヒト手術検体より採取し分離した滑膜細胞を用いた実験もいくつか行ったところ、個体差はあるものの、同様の傾向が認められた。FGF2誘引フィブロインでは、細胞増殖効果により厚い細胞層が得られていたが、軟骨分化を軽度抑制する可能性が示唆された。今後は、細胞層に対してさらに詳細な生化学的検討を行い、この結果を検証する予定である。

Strategy for Future Research Activity

令和4年度も、引き続きフィブロインスポンジ上で作製した細胞シートを軟骨分化誘導培地で培養し、軟骨分化について検討する。令和3年度の研究結果では、FGF2誘引フィブロイン群において細胞増殖効果により厚い細胞層が得られていたが、軟骨分化に関しては軽度抑制される可能性が示唆された。令和4年度はこの結果を、生化学的に定量評価することでさらに詳細に検討する予定である。生化学的検討として、滑膜細胞層をpapainにて酵素処理後、DNA量（ヘキストダイによる定量）、プロテオグリカン含有量（DMMB法）、コラーゲン含有量（HPLCによるハイドロキシプロリン量）を測定する。またRNAを抽出し、real-time RT-PCR法によるI, II 型コラーゲン、アグリカン、Sox9の遺伝子発現定量を行う。
FGF2は滑膜や骨髄由来の幹細胞の軟骨分化を促進するという報告がある一方で、最終分化は抑制するという報告も散見される。今回の結果が出た要因については、１．FGF2は軟骨シート形成後の軟骨分化には抑制的に作用する、２．FGF2は軟骨シート形成後の軟骨分化を促進するが、FGF2誘引フィブロインの誘引効果が培養中に低下（誘引タンパクのFGF結合能の低下など）する、等が考えられた。１の仮説を検証する目的で、rhFGF2の添加を続けた場合と、途中で中止した場合とで軟骨分化の程度を評価する実験、２の仮説を検証する目的で、FGF2誘引フィブロインを一定期間rhFGF2添加培養液内に保管した後に実験に用いる、などの実験を追加で行う予定である。

Causes of Carryover

令和3年度は細胞増殖に関する検討を中心に行い、ウシ胎児血清、細胞培養試薬、消耗品の使用量はほぼ予定通りであった。次年度使用額は53,432円と少額生じたが、これらは令和4年度配分金を合わせ、ウシ胎児血清、細胞培養試薬、消耗品の購入に使用する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Serum Reactive Oxygen Metabolites as a Predictor of Clinical Disease Activity Index, Simplified Disease Activity Index, and Boolean Remissions in Rheumatoid Arthritis Patients Treated With Biologic Agents. (2021)
  • Author(s): Nakajima A, Terayama K, Sonobe M, Akatsu Y, Saito J, Norimoto M, Taniguchi S, Kubota A, Aoki Y, Nakagawa K.
  • Journal Title: Cureus Volume: 19;13(11) Pages: e19759
  • DOI: 10.7759/cureus.19759
  • Peer Reviewed
• [Presentation] FGF2誘引型絹フィブロインによるヒト間葉系幹細胞の増殖効果 (2021)
  • Author(s): 山田 学, 櫻井香代, 中島 新, 園部正人, 赤津頼一, 齊藤淳哉, 乗本将輝, 小山慶太, 山本景一郎, 玉田 靖, 中川晃一.
  • Organizer: 第36回日本整形外科学会基礎学術集会