2021 Fiscal Year Research-status Report
Functional analysis of Sox9/Scx-target genes for regenration of shoulder rotator cuff enthesis
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20K09482
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
前田 真吾 鹿児島大学, 医歯学総合研究科, 特任准教授 (60353463)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
谷口 昇 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 教授 (20626866)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 腱板損傷 / Sox9 / Scleraxis / enthesis |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、肩関節腱板断裂の再断裂の主な原因であるenthesis再生不良の原因解明を目的として、Sox9/Scxのgain/loss-of-function後のマイクロアレイ解析でその標的遺伝子を検索・同定し、その分子の機能を解析する事を目指している。前年度はBMPsを含む各種TGF-βファミリー・リガンドをそれぞれ添加した結果、TGF-β1, TGF-β2, myostatin, activin AにSox9/Scx double positive状態を誘導する能力があることが分かった。本年度は、Sox9とScxの過剰発現系構築の為に、まずアデノ随伴ウイルス(AAV)システムを構築した。AAVの初代マウスMSCへの導入を行ったが、内因性同遺伝子に対して10倍以下の発現レベルしか得られなかった。従って細胞の表現型に繋がる変化を得られなかった為に、アデノウイルスシステムへの変更の必要性が生じた。アデノウイルスは構築されつつあり、次年度はSox9/Scx標的遺伝子の検索が可能となる予定であり、上記リガンドの効果とも比較する。標的遺伝子の効果を検討するための動物モデル、すなわちマウスおよびラット肩腱板損傷モデルの構築も開始し、完成している。その表現型を経時的に解析し、今までに報告のない骨軟骨の変化も観察できており、enthesisとの分子的・機能的関連も示唆される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
アデノ随伴ウイルスによる過剰発現系が予想に反して効率が悪く、低レベルの遺伝子導入に終わった為に、アデノウイルスシステムへの変更を余儀なくされた。アデノウイルスシステムの構築もまた時間がかかるので、鋭意進行中であるが、場合によっては外注による構築に変更する事も想定している。
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| Strategy for Future Research Activity |
アデノウイルスによるSox9/Scx過剰発現による効果について、MSCの分化への影響を、軟骨(Sox9/5/6, Agc1, Col2a1, Col11a2, Col10a1など)と腱・靭帯 (Scx, Tnmd, Mkx, Col1a1, Fmod, Col3a1など)のマーカーの定量的RT-PCR法やウエスタン・ブロット法で解析する。期待通りの結果が得られたなら、新規誘導遺伝子をマイクロアレイで検索する。その結果をTGF-β1, TGF-β2, myostatin, activin Aの効果とも比較し、共通項を探る。抽出遺伝子のアデノウイルスを作製し、上記効果の再現性を確認し、再現できた遺伝子を標的遺伝子とする。抽出遺伝子のプローモーター／エンハンサー配列を検索してSox9/Scx結合予想配列があれば、Sox9/Scxのクロマチン免疫沈降実験を行い、直接標的遺伝子か検証する。この遺伝子のin vivoでの発現を正常マウスおよび腱板損傷マウスの腱板enthesisで検討する（免疫組織化学染色またはin situ hybridization）。MSCに標的遺伝子を導入した上で、tissue-engineered tendon を作製し、腱板損傷モデルに移植して効果を評価する。さらにマウスenthesis 針刺入損傷モデルや、腱板断裂suture bridge修復モデルに対しても、同様に検討する。標的遺伝子のshRNAレンチウイルスを導入してloss-of-functionも精査する。
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| Causes of Carryover |
残額は少額でほぼ計画的に執行しており、問題なく次年度で執行可能である。
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[Journal Article] CDC5L promotes early chondrocyte differentiation and proliferation by modulating pre-mRNA splicing of SOX9, COL2A1, and WEE1.2021
Author(s)
Jokoji G, Maeda S, Oishi K, Ijuin T, Nakajima M, Tawaratsumida H, Kawamura I, Tominaga H, Taketomi E, Ikegawa S, Taniguchi N.
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Journal Title
Journal of Biological Chemistry
Volume: 297
Pages: 100994
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] CDC5LはSOX9, COL2A1,Wee1のpre-mRNAスプライシングを調整し初期軟骨細胞分化と増殖を促進する2021
Author(s)
城光寺豪, 前田真吾, 大石一樹, 伊集院俊郎, 中島正宏, 俵積田裕紀, 河村一郎, 冨永博之, 武冨榮二, 池川志郎, 谷口昇
Organizer
第36回日本整形外科学会基礎学術集会
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