CD146/271陽性脂肪幹細胞の関節内直接投与による変形性関節症治療効果の検討

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K09498
• Research Institution: University of Fukui
• Principal Investigator: 宮崎 剛 福井大学, 学術研究院医学系部門(附属病院部), 講師 (80324169)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 内田 泰善 福井大学, 学術研究院医学系部門(附属病院部), 医員 (60838704) [Withdrawn]
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: AD MSCs / PLA cell / 軟骨再生 / CD271陽性細胞

Outline of Annual Research Achievements

令和２年度の実績
【AD-MSCs Isolation and In Vitro Proliferation】
① SD ratの腹部及び背部の脂肪組織を採取。② Collagenase処理後洗浄、cell strainer通過後の細胞を採取。③ 10cm培養ディッシュに播種。3日毎に培地交換。細胞が75％コンフルエントになった時、継代。④ 3週後に細胞数7.0 million に達したあとに分離凍結保存した。
【CD271/164+ AD-MSCs sorting】
① 上記で培養した細胞をMiltenyi AutoMACSを用いて、MSC Research Tool Box-CD271, 164 isolation Kitを用いてCD271/164+cellを分離。② 10cm培養ディッシュに播種。3日毎に培地交換。細胞が75％コンフルエントになった時、継代。③ 上記で得られた細胞の特性解析(未分化性、増殖、生存)を行った。④ 更に上記細胞についてFACSで細胞の単一性についてチェックした。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

上記の様に当初の予定通り研究が進行している。

Strategy for Future Research Activity

令和３年度
【表面抗原染色】(SSEA-3,4＆TRA-1-60,81)
① 分散したAD-MSCsを１×107 cells/mlの濃度でBD CytoFixTM fixation buffer で懸濁する。② 1ml BD Perm/WashTM bufferに懸濁。再度遠沈後100μl BD Perm/WashTM bufferに懸濁。③ AD-MSCs １×107 cellsあたり20μlの抗体液を添加して懸濁フローサイトメーターで解析、未分化性、増殖、生存について評価を行う。
令和４年度
Ⅱ　臨床応用に向けての条件設定
OA自然発症モデルであるハートレー系モルモットを用いて膝関節内へAD-MSCsを液状のscaffoldとともに注入し、関節軟骨内への細胞の取り込みを評価する。次にさらに大型動物として日本白色家兎を用いて膝前十字靭帯と内側半月を切除して実験的変形性膝関節症モデルを作成する。軟骨変性を組織学的に評価し、初期変形性関節症と、進行期、末期のグループを作成し、そのモデルに対してAD-MSCsをscaffoldとともに関節内へ注入する。対照群としてにscaffoldのみを関節内に注入した群を作成し、関節内注入後3ヵ月にて屠殺後、膝関節軟骨において組織切片を作製しサフラニンO染色やアグリカンやコラーゲンIIの発現量について免疫染色を用いて軟骨面の状態について評価検討を行う。またCD271/164＋細胞についても上記と同様の実験を行い軟骨形成の状態について比較検討を行う。

Causes of Carryover

補助事業の誠実な執行に努めた結果、当初計画より経費の使用が節約できたことにより未使用額が生じた。

当該未使用額を次年度に持ち越して追加の試薬・抗体・消耗品等購入する。