2020 Fiscal Year Research-status Report
The elucidation of osteoarthritis pathogenesis based on the osteogenic culture experiment of induced pluripotent cells with the modification of oxygen tension
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20K09508
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| Research Institution | Nara Medical University |
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Principal Investigator |
稲垣 有佐 奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (60707529)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岡村 建祐 奈良県立医科大学, 医学部附属病院, 研究員 (60812691)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 変形性膝関節症 / ヒト人工多能性幹細胞 / 骨分化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
変形性膝関節症(KOA) の早期治療は我が国にとって大変重要な課題であるが、その発症に関与する分子レベルでの反応の詳細については未だ明らかにされていない。申請者は低酸素環境中のラット骨髄間葉系幹細胞(MSCs) が通常酸素環境へ暴露されることで骨形成能が促進されることを既に報告した。本研究の目的は、ヒト人工多能性幹細胞(iPSCs) を用い、上記の酸素濃度変化時の遺伝子発現量の解析等を従来より正確性に重点を置いて行い、その結果から分子レベルでの機序を解明し、KOAのみならず他関節OAの病態解明と、将来的にそれに対応した新規薬剤の開発に資することである。
まずはiPSCsを通常酸素環境下に骨分化誘導培養し、アルカリフォスファターゼ(ALP染色)、アリザリンレッド染色、逆転写-定量的リアルタイムポリメラーゼチェーンリアクション(RT-qPCR)にてiPSCsの骨分化を評価した。また、RT-qPCRにおいて、適切な内在性コントロール遺伝子の設定が重要であり、複数のアルゴリズム解析の結果、従来より使用されてきたグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH) やβアクチン(ACTB)ではなく、TATA box binding protein (TBP)が最も安定しており、本実験系に最も適切な内在性コントロール遺伝子であることが判明した。結果として、ALPおよびアリザリン染色陽性、RT-qPCRにて未分化マーカー遺伝子の減少、骨形成関連遺伝子の増加を認め、iPSCs骨分化誘導が示唆された。以上を本研究の業績として査読有英文誌発表を行った。
次に、iPSCsを低酸素環境に馴化させることに成功し、培養中全期間通常酸素環境、低酸素環境、本研究のターゲットである低酸素環境から通常酸素環境の3群で骨形成培養を行いい、結果解析中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
通常酸素環境でのiPSCs骨分化誘導に成功し、RT-qPCRにおける最適な内因性コントロール遺伝子の決定しを査読有英文誌に報告した。現在、iPSCsを低酸素環境に馴化させることに成功し、培養中全期間通常酸素環境、低酸素環境、本研究のターゲットである低酸素環境から通常酸素環境の3群で骨形成培養を行い、結果解析中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後、iPSCs骨分化誘導培養時に低酸素環境から通常酸素環境へと変化した際の遺伝子発現解析を行っていく予定である。さらに人工膝関節置換術時に、同意のもと採取した骨軟骨組織を、まず基本的な組織学的評価を行ったうえで、上記にて選定した分子について免疫染色を行い、実際のKOAの病態にも関与しているかを検証する。またその結果と、検体を採取する膝関節について術前に予め撮像しておいた核磁器共鳴(MR)画像から得た軟骨病変の重症度パラメータとの比較検討も行っていく予定である。
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| Causes of Carryover |
コロナの影響もあり研究課題1年目の物品費、旅費等支出が想定より少なく、次年度使用額が生じているが、2、3年目で使用予定である。今後、iPSCs骨分化誘導培養時に低酸素環境から通常酸素環境へと変化した際の遺伝子発現解析を行っていく予定である。さらに人工膝関節置換術時に、同意のもと採取した骨軟骨組織を、まず基本的な組織学的評価を行ったうえで、上記にて選定した分子について免疫染色を行い、実際のKOAの病態にも関与しているかを検証する。またその結果と、検体を採取する膝関節について術前に予め撮像しておいた核磁器共鳴(MR)画像から得た軟骨病変の重症度パラメータとの比較検討も行っていく予定である。
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Research Products
(6 results)
