2021 Fiscal Year Research-status Report
3D structure Tissue Engineering of lower urinary tract using mesenchemal stem cells.
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20K09522
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
石塚 修 信州大学, 学術研究院医学系, 教授 (20184541)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
今村 哲也 信州大学, 学術研究院医学系, 助教 (00467143)
上野 学 信州大学, 学術研究院医学系(医学部附属病院), 助教 (00816340)
永井 崇 信州大学, 学術研究員医学系(医学部), 特任研究員 (50514353)
皆川 倫範 信州大学, 学術研究院医学系(医学部附属病院), 講師 (60638873)
小川 輝之 信州大学, 学術研究院医学系, 准教授 (90467142)
道面 尚久 信州大学, 学術研究院医学系(医学部附属病院), 特任研究員 (90750878)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 再生医療 / 膀胱 / 脂肪幹細胞 / 骨髄幹細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ラットの大腿骨骨髄より注射針で骨髄由来幹細胞を採取し15% fetal bovine 血清および抗生剤附加のDulberco Modified Eagle Medium の中に入れた。これらの細胞を遠心分離した後に、TypeⅠcollagen でコートした培養皿で７日間初代培養した。培養皿上に接着伸展した骨髄由来幹細胞を集め、立体構造体作成用の細胞塊（スフェロイド）を作成した。また、これらの実験動物の皮下脂肪細胞からも同様な細胞採取を行い、脂肪幹細胞由来の細胞塊を作製できるか検討し、骨髄細胞と比較した場合の細胞塊の作製効率、有用性を比較検討した。培養途中の5 日目の時点で、Lipofectamine 2000 Reagent を使用し、GFP（Green fluorescence protein）発現遺伝子を培養細胞内にトランスフェクションしてマーキングした。細胞塊（スフェロイド）を使用し、３Ｄプリンタの剣山デバイス上に刺し並べて、予め設計したデザインの三次元組織を作成した。漿膜側より-80℃のアイスバーで障害を受けた膀胱モデル、もしくは-80℃のアイスバーで内尿道括約筋の障害を受けた腹圧性尿失禁モデル、尿管を途中から断裂させた尿道損傷モデルに対しても三次元立体構造体の移植を行った。移植後3 日目、14 日目に膀胱および尿道を取りだし、Monoclonal anti-GFP 抗体、平滑筋特異抗体を使用して免疫二重染色を行い、レーザー蛍光顕微鏡で移植した細胞の分化、つまり、筋層をはじめとする膀胱および尿道括約筋の再生を観察した。また、14 日目においては、Acta2 primer を使用してalpha smooth muscle actin を、Myh11primer を使用してsmooth muscle myosin heavy chain を、Real time RT-PCR 法にて定量測定し、骨髄幹細胞もしくは脂肪細胞の膀胱平滑筋、内尿道括約筋への分化、尿道括約筋、尿管の再生についての評価も行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ラットの大腿骨骨髄より注射針で骨髄由来幹細胞を採取し、培養皿上に接着伸展した骨髄由来幹細胞を集め、立体構造体作成用の細胞塊（スフェロイド）を作成することができた。また、培養細胞のマーキングも、GFP（Green fluorescence protein）発現遺伝子を培養細胞内にトランスフェクションしてマーキングすることができた。その後、細胞塊（スフェロイド）を使用し、３Ｄプリンタの剣山デバイス上に刺し並べて、予め設計したデザインの三次元組織を作成することができた、損傷を受けた膀胱、尿道、尿管へ移植し、再生の確認ができたので、おおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
膀胱および尿道括約筋を摘出しなかった別の移植ラット群（もしくはラビット群）においては、覚醒下無拘束状態下での膀胱内圧検査を行うことによって、膀胱としての機能の再生を確認する。また、腹圧時尿漏出時圧測定を行うことによって尿道括約筋としての収縮機能が再生したか検証し、レントゲン撮影にて、管腔臓器としての機能を形態的に検証する。最終的には膀胱、尿道括約筋などの下部尿路再生に応用することを目標としている
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| Causes of Carryover |
当初計画した予算よりも安く、実験用の試薬、薬品などを購入することが可能であった。次年度使用額は令和4年度請求額と合わせて消耗品費として使用する予定である。
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[Journal Article] Influence of background characteristics in responders of regenerative therapy by periurethral injection of adipose-derived regenerative cells for male stress urinary incontinence.2022
Author(s)
Yamanishi, T., Ishizuka,O., Shimizu, S., Kobayashi, Y., Kinoshita, F., Yamamoto, T., Mizokami, A., Narimoto, K., Toriyama, K., Kamei,Y., Kuwatsuka,Y., Mizuno,M., Gotoh, M.
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Journal Title
Low Urin Tract Symptoms.
Volume: 14
Pages: 273-280
DOI
Peer Reviewed
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