2021 Fiscal Year Research-status Report
Identification of the enhancer sequences that are controlled by androgen receptor
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20K09539
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
藤田 潤 京都大学, 医学研究科, 客員研究員 (50173430)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
赤松 秀輔 京都大学, 医学研究科, 准教授 (20767248)
武田 俊一 京都大学, 医学研究科, 教授 (60188191)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | アンドロゲン / LNCap / 前立腺癌 / トランスクリプトーム / エンハンサー / c-MYC |
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| Outline of Annual Research Achievements |
エキソーム解析技術により前立腺の発癌や去勢抵抗性に関わる遺伝子異常が明らかになっている。今後、全ゲノムの次世代シーケンスにより非コーディング領域にも解析が広がる。ただし非コーディング領域のほとんどをジャンク配列が占めることを考慮すると、非コーディング領域の中から機能配列を選択し、そこに入った変異に焦点をあてて解析する手法を確立しなければならない。本研究の目的は、機能配列の中で、アンドロゲン受容体依存的に活性化される転写制御領域（エンハンサー配列）を網羅的に同定することである。恒常的に活性化されているエンハンサーは従来法（例、ゲノム全体のDNase I hypersensitivity site決定）によって同定されるが、細胞刺激（例、アンドロゲン曝露）後に一過性に活性化されるエンハンサーは従来法で検出できない。我々が採用する手法は、前立腺癌細胞 (LNCap) をアンドロゲン刺激後にRNA抽出し、それをNET-CAGE法（Nature Genet 2019, PMID: 31477927）によってトランスクリプトーム解析することである。eRNA検出は、細胞刺激依存的に転写制御を行うエンハンサーを検出できる唯一の手法である。我々は、実際に、2,000以上のアンドロゲン依存的エンハンサー配列候補を新たに同定した。同定されたエンハンサーには、前立腺発癌や去勢抵抗性に関わる点変異が濃縮されているはずである。我々は、アンドロゲン依存的エンハンサーの１つ、c-MYC遺伝子エンハンサーにおいてアンドロゲン曝露時に一過性にDNA topoisomerase II (TOP2) が ゲノム切断を作ることを見出した。この切断が修復されず残った場合に、c-MYC が異常高発現することを示唆するデータを得た。この現象を確認し、異常高発現の作用機序を今後解明する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は、前立腺癌細胞 (LNCap)をアンドロゲン刺激後にRNA polymerase II (Pol2)が未だ合成中のRNA（nascent RNAと呼ぶ）を抽出し、それをトランスクリプトーム解析する。本研究の成否は、この抽出RNAの品質にかかっている。NET-CAGE法を開発した村川教授の研究室でnascent RNA抽出を行うことにより高品質のRNAを抽出できた。我々は既に、アンドロゲン刺激前と刺激後30分, 60分, 180分, 360分後の野生型LNCap細胞からRNAを精製する実験を3回繰返した（3回繰返し×5点の時間＝合計15試料）。我々は、野生型LNCap細胞のみならず、TDP2遺伝子破壊LNCap細胞（Mahmud RA. et al., Genes Cells 2020）でも同様の実験を実施し、合計15試料のnascent RNAを抽出した。そして30 RNA試料を企業（DNAFORM、横浜）に送付し、2021年度に解析した。具体的には、コンピューター上の作業で全アンドロゲン刺激依存的全eRNAが検出し、 新たに2000カ所以上のアンドロゲン依存的転写応答の調節塩基配列（エンハンサー）の候補を発見した。以上の実験の進展から『おおむね順調に進展している』と自己判定した。
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| Strategy for Future Research Activity |
推進方策について、２つ方向性がある。
1. NET-CAGEで同定されたエンハンサーをコンピューター上で解析 (1) 細胞増殖に関与するエンハンサーをリストアップ：アンドロゲンが発現誘導させる遺伝子の中で、発癌に関与する遺伝子（例、c-MYC）を転写活性化するエンハンサーを同定。(2) (1)のエンハンサー配列の中にある前立腺癌体細胞変異を全部同定
2. TDP2欠損の、アンドロゲン依存的細胞増殖への増強効果の機序を解明
TDP2は、DNA topoisomerase II (TOP2) が作るゲノム切断を選択的に修復する酵素である。TOP2が作るゲノム切断は、性ホルモンなどの刺激の直後に多発する。TDP2遺伝子の変異が前立腺癌で多く見つかる。我々は、TDP2が機能欠損するとアンドロゲン依存的な前立腺上皮増殖が大きく増加することを見出した（Mahmud RA. et al., Genes Cells 2020）。アンドロゲン注射後にc-MYC高発現にすることも確認した（未発表）。高発現の作用機序についての、我々の作業仮説は、TDP2欠損では『アンドロゲン依存的なエンハンサーに生じたTOP2依存的ゲノム切断が効率よく 再結合されない結果、切断がエンハンサーを異常活性化しc-MYCを高発現する』である。この仮説の是非を以下の実験計画により検証する。(1) TDP2欠損LNCapをアンドロゲン刺激後、c-MYC遺伝子のアンドロゲン依存的エンハンサーに切断が生じることを、γH2AX ChiP で確認する。(2) CRISPR/Cas9をヒト乳癌細胞株（野生型）で発現させて、c-MYC遺伝子エンハンサーを人工的に切断する。この人工切断が実際にc -MYCの異常高発現を起こせば、エンハンサーの切断がc-MYCの異常高発現で原因であると結論できる。
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Research Products
(1 results)
