エピゲノム不妊発症の分子機構解析

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K09543
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 富澤 信一 横浜市立大学, 医学部, 講師 (00704628)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: Tsga8 / 精子形成 / 不妊

Outline of Annual Research Achievements

本研究はヒストンメチル化酵素KMT2Bが制御する遺伝子を同定し、それらの精子形成および不妊にかかわる機能を調べることを目的としたものである。Kmt2bは精子幹細胞分化やその後の精子形成に必要な遺伝子であり、本研究ではその制御下にあると考えられる複数の遺伝子（プロモーターにH3K4me3を導入する）を同定した。中でも、Kmt2bを欠損した際に、H3K4me3レベルやmRNAの発現レベルで最も影響を受けるTsga8遺伝子を見出し、その精子形成における重要な役割を明らかにすることができたため、ここに報告する。Tsga8遺伝子はマウスのX染色体上にコードされており、そのmRNAやタンパク質は精子細胞において特異的な発現を示した。そこでCRISPR-Cas9を用いてTsga8のノックアウトマウスを作製したところ、雄マウスは完全な不妊を示すことが明らかになった。さらに、ノックアウトマウスの精巣では伸長精子細胞の頭部の形態や、核内の凝集度に明らかな異常が認められた。核内DNAの凝集に必要なTNP1やPRM1などのタンパク質はノックアウトマウスの精巣で減少していた。また、そのような異常な精子細胞はアポトーシスを起こし貪食されることもわかり、結果として精巣上体には正常な形態を示す精子はほとんど見られなかった。RNA-seq法によりノックアウトマウスの精巣で発現に影響を受けた遺伝子を調べると、多くのX染色体遺伝子が正常に活性化できていないことが分かった。つまり、TSGA8タンパク質は精子細胞の発生に必要なX染色体活性化やヒストン-プロタミン置換による核内凝集、精子細胞の形態形成を誘導するために必須の役割を有することが分かった。これらは雄性不妊の解明につながる重要な知見である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

現在までにKmt2bが制御する遺伝子を、次世代シークエンサーデータ（精子幹細胞系の培養細胞を用いたRNA-seqやH3K4me3のChIP-seqデータ: Development, 2018, 145: dev169102）を活用することで、複数同定することができた。またその代表例として同定したTsga8遺伝子をノックアウトしたCRISPR-Cas9マウスを予定通り作製し、組織学的、分子生物学的な側面から詳細に解析したことで、Tsga8がマウスの精子形成に必須の役割を有することを初めて明らかにすることができた。Tsga8遺伝子に関してはその遺伝子発現やタンパク質発現のパターンを解析した研究を始め、いくつかの論文報告が存在する。ところが、その精子形成における具体的な機能を明らかにした論文はこれまで存在しなかった。そのような中、本研究ではTsga8が精子細胞の発生において果たす重要な役割を詳細に示すことができた。特に、精子細胞におけるX染色体の活性化、TNP1やPRM1などのタンパク質により誘導されるDNA凝集、細胞の形態変化による伸長精子細胞の発生など、いくつもの現象が起きるためにTsga8が欠かせない因子であったことは精子形成研究において重要な知見であるということができる。これらの成果は国際誌において論文発表を行った(Kobayashi, Tomizawa et al., Development, 2021, 148: dev196212)。

Strategy for Future Research Activity

今後は、Kmt2bが制御する遺伝子の中でも、Tsga8以外の遺伝子の機能を引き続き明らかにすることを目指す。現在までに、Kmt2bがH3K4me3やmRNA発現を制御すると考えられる遺伝子を複数同定しており、それらの遺伝子のノックアウトマウスを作製している。その中には、TG2遺伝子をはじめとする、精子形成過程で特異的な発現を示す遺伝子が含まれている。TG2遺伝子はその発現パターンから精子形成に必要な重要な機能を有する可能性を持つと考えられる遺伝子である。そのため、免疫染色法や電子顕微鏡を用いた解析などの組織学的解析や、RNA-seq法を用いた分子生物学的解析を組み合わせた複合的な解析を行い、それらの遺伝子の精子形成における機能を詳細に明らかにしていきたい。最終的には、Kmt2bがかかわるエピゲノムが制御する精子形成機構の全体像を明らかにすることを目標とする。それにより、エピゲノムの異常によって引き起こされる男性不妊症について、新たな知見が得られることが期待できる。

Causes of Carryover

初年度はTsga8マウスの解析に集中したことで、予定したマウスの使用数を抑えることができた。また計画した他のノックアウトマウス解析と、それに伴って必要となる次世代シークエンサー解析の一部を次年度以降に実施することとしたため。

Research Products

• [Journal Article] Tsga8 is required for spermatid morphogenesis and male fertility in mice (2021)
  • Author(s): Kobayashi Y, Tomizawa S, Ono M, Kuroha K, Minamizawa K, Natsume K, Dizdarevic; S, Dockal I, Tanaka H, Kawagoe T, Seki M, Suzuki Y, Ogonuki N, Inoue K, Matoba S, Anastassiadis K, Mizuki N, Ogura A, Ohbo K.
  • Journal Title: Development Volume: 148 Pages: dev196212
  • DOI: 10.1242/dev.196212
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Presentation] Regulation of spermatogenesis by Kmt2b-dependent epigenome in spermatogonial stem cells (2021)
  • Author(s): Yuki Kobayashi, Shin-ichi Tomizawa, Michio Ono, Kazushige Kuroha, Tatsukata Kawagoe, Masahide Seki, Yutaka Suzuki, Narumi Ogonuki, Kimiko Inoue, Shogo Matoba, Nobuhisa Mizuki, Atsuo Ogura, Kazuyuki Ohbo
  • Organizer: 第14回エピジェネティクス研究会年会