2020 Fiscal Year Research-status Report

Development of novel treatments for chronic kidney disease with biofabricated cell sheets

Research Project

Project/Area Number	20K09556
Research Institution	Shinshu University
Principal Investigator	道面尚久信州大学, 学術研究院医学系(医学部附属病院), 助教 (90750878)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	今村哲也信州大学, 学術研究院医学系, 助教 (00467143)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	慢性腎臓病 / 細胞シート工学 / 脂肪組織由来間葉系幹細胞 / 凍結傷害 / ラット
Outline of Annual Research Achievements	慢性腎臓病は、新たな国民病と位置づけられる疾患であり、腎不全に至ると透析療法や腎移植などの腎代替療法が必要となる。これらの代替療法には、課題が山積している。本研究は、慢性腎不全への移行段階での病期ステージの進行を抑制して、正常な腎機能へと回復させることを目的とした新規治療開発の基礎研究を行う。今年度は、自己脂肪組織から採取した間葉系幹細胞と細胞の足場素材としてのゼラチンシートを組み合わせた積層型デュアル間葉系幹細胞シート（以下、積層細胞シート）を作製した。同時に、先行研究で確立したラット腎凍結傷害腎不全モデルを用いて、積層細胞シートの移植方法等の検討をした。その成果として、腎臓に凍結傷害を与えた後、腎被膜下への積層細胞シート移植する一連の実験方法を確立した。また、積層細胞シートをパッチ移植すると、術後2，4週目の尿中タンパク、血中クレアチニン、尿素窒素などの腎機能を評価する項目において、経時的な腎機能の増悪が、偽手術を行った対照群と比較して抑制される傾向を確認した。現在、実験動物数を増やすために実験を繰り返している段階である。また、同時に、腎機能回復の機序として、積層細胞シート移植による腎組織の改善が関連しているのかどうか評価する組織学的解析を開始した。今後、腎機能増悪の抑制効果、あるいは、腎組織再生の機序を解明していく。さらに、今後の慢性腎臓病の新規治療開発研究における重要な基盤を築くための準備実験を進める。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 1: Research has progressed more than it was originally planned. Reason 今年度は、本研究を遂行するための一連の実験過程を確立した。移植1週間前に、右腎周辺の脂肪組織を採取して、右腎を摘除した。採取した自己脂肪組織から初代培養によって脂肪由来間葉系幹細胞を回収した。続いて、細胞標識を行った後、温度応答性培養皿に播種、継代培養を経て、シート状になった脂肪由来間葉系幹細胞をゼラチン繊維基材で回収した。それを2枚積層したものを積層型デュアル間葉系幹細胞シート（以下、積層細胞シート）とした。また、移植1週間前に、細胞を採取したラットに対して、残った左腎に対して、腎動静脈をクランプして腎門部周辺に液体窒素を60秒噴霧した。室温下で凍結部位が融解した後、腎被膜を慎重に剥離して、ポケット状のスペースを作り、積層細胞シートを差し込み、腎臓へのパッチ移植（自家移植）を行った。また、ゼラチン繊維基材のみをポケット状のスペースに差し込んだものを対照群とした。移植2，4週後、尿中タンパク、血中クレアチニン、尿素窒素の経時的な変化から積層細胞シート群は、対照群と比較して腎機能増悪が抑制される傾向を確認した。現在、実験動物数を増やすために実験を繰り返している段階である。また、同時に、腎機能回復の機序として、積層型細胞シート移植による腎組織の改善が関連しているのかどうか評価する組織学的解析を開始した。以上から、本研究は、当初の計画以上に進展していると判断した。
Strategy for Future Research Activity	今年度、本研究を遂行するための一連の実験過程を確立できた。さらに、積層細胞シートのパッチ移植による腎機能の増悪の抑制が確認できた。したがって、次年度は、統計処理が可能になる実験動物数になるまで実験を繰り返すとともに、組織学的解析を中心とした評価により、腎機能回復における機序を明らかにする。また、実用化技術へ向けた基盤の構築を進める。
Causes of Carryover	当初計画していた細胞足場基材（ゼラチンシート、Genocel）を定価より安価で購入できた。その差額分である。本使用額の差額は、次年度の研究での値上げされた消耗品購入における補填に使用する。