前立腺癌ＡＲ-Ｖ7標的遺伝子の同定を目的とした網羅的エピゲノム解析

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K09572
• Research Institution: Chiba University
• Principal Investigator: 今村 有佑 千葉大学, 医学部附属病院, 講師 (10568629)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 坂本 信一 千葉大学, 医学部附属病院, 講師 (70422235)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 前立腺癌

Outline of Annual Research Achievements

前立腺癌の治療としてアンドロゲン除去療法が初期には有効であるが、去勢抵抗性前立腺癌（CRPC）への進行が臨床的問題である。CRPCにいたる分子機構の一つにアンドロゲン受容体（Androgen Receptor;AR）のリガンド結合部位が欠失したSplicing Variants、特にAndrogen Receptor Splicing Variant7（AR-V7）の異常発現が注目されているがAR-V7の役割については不明な点が多い。そこでAR-V7標的遺伝子の解明およびCRPCに対する新たな治療戦略の設立を目的として、次世代シーケンサーを用いたRNA-seq法、ChIP-seq法により遺伝子発現およびAR結合部位、AR-V7結合部位、ヒストン修飾変化の統合解析を行い、AR-V7下流標的遺伝子とその制御を網羅的に同定し、これら下流標的遺伝子の機能解析を行うことを目的とした。
令和3年度はARを発現するLNCaP細胞株およびAR-V7を発現するLNCaP95細胞株を用いて、ChIPおよび網羅的解析（ChIP-seq）により、ゲノムワイドなAR, AR-V7の標的遺伝子を解明することを試みた。候補遺伝子の発現の比較検討を行い、実際にLNCaP95において発現上昇している候補遺伝子についての絞り込みを行った。またその候補遺伝子がコードする蛋白について前立腺癌細胞における発現、またその機能解析を行い、新たな治療標的となり得るドライバー標的遺伝子を同定した。
また、臨床検体として千葉大学泌尿器科において前立腺生検および前立腺全摘術にて摘出された標本の病理組織標本に対して、機能解析を行ったドライバー標的遺伝子のコードするタンパクの免疫組織学析および組織中の発現解析を行い、臨床データを用いて予後との関連を解析した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ChIP-seq解析で同定された399個のAR-V7標的領域のうち、377個はARと共通の標的であり、22個がAR-V7特異的であった。これらのAR-V7標的領域と結合している78個の遺伝子はLNCaP95で高発現しており、AR-V7ノックダウンによりこれらの遺伝子を有意に抑制し、LNCaP95の細胞増殖を抑制した。78個のAR-V7標的遺伝子のうち 74個がAR/AR-V7共通の標的遺伝子、4個がAR-V7特異的な標的遺伝子であり、その中で特にAR-V7ノックダウンにより、NUP210とSLC3A2がそれぞれノックダウンされた。NUP210とSLC3A2は臨床検体のCRPC組織で有意に発現し、そのノックダウンによりLNCaP95の細胞増殖は抑制された。
そのSLC3A2が制御する蛋白として4F2hcについてさらにその機能解析を行い、前立腺癌細胞C4-2においてsiRNAを用いて4F2hcをノックダウンすると細胞増殖を抑制することが判明した。これらの細胞増殖抑制効果は、その下流であるSKP2を介して起こることがわかり、臨床検体を用いて4F2hcの免疫組織学的解析を行ったところ、4F2hc高発現は多変量解析の結果、無増悪生存期間の独立した予後因子であり、臨床病期およびグリソンスコアと関連し予後との関連が示唆された。これらの結果をまとめ、論文発表した（Sci Rep. 2021 Jun 1;11(1):11478.）。

Strategy for Future Research Activity

TCGA、Grasso等の公共データベースを使用し、AR-V7高発現前立腺癌において同定したAR-V7標的遺伝子が発現上昇しているか解析を行う。また同定したAR-V7標的遺伝子NUP210について、SLC3A2と同様に前立腺癌細胞を用いて機能解析を行い、新たな治療標的となり得るドライバー標的遺伝子の同定を試みる。またドライバー遺伝子に対する薬剤の抗腫瘍効果を判定し、新期治療標的としての可能性を検討する。さらにFlow cytometryを使用し薬剤による細胞周期の変化やアポトーシス誘導に関して解明する。
また、臨床検体については、病期、治療情報、治療反応性、予後などの臨床情報を収集し患者検体と臨床情報の照らし合わせを引き続き行っていく。そのうえで収集済みの組織において機能解析を行ったドライバー標的遺伝子のコードするタンパクの免疫組織学的解析および組織中の発現解析を行う。また当科の臨床データを用いて予後との関連を解析する。

Research Products

• [Journal Article] The heavy chain of 4F2 antigen promote prostate cancer progression via SKP-2 (2021)
  • Author(s): Maimaiti Maihulan、Sakamoto Shinichi、Sugiura Masahiro、Kanesaka Manato、Fujimoto Ayumi、Matsusaka Keisuke、Xu Minhui、Ando Keisuke、Saito Shinpei、Wakai Ken、Imamura Yusuke、Nakayama Keiichi、Kanai Yoshikatsu、Kaneda Atsushi、Ikehara Yuzuru、Ikeda Jun-Ichiro、Anzai Naohiko、Ichikawa Tomohiko
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 11 Pages: 11478
  • DOI: 10.1038/s41598-021-90748-9
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research