Immunological accommodation, Treg/Breg and co-stimulatory signal in ABO-incompatible kidney transplantation

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K09573
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 齋藤 和英 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (20262438)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田崎 正行 新潟大学, 医歯学総合病院, 助教 (40571906)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: ABO血液型不適合腎移植 / 免疫学的順応 / 免疫寛容 / 共刺激分子

Outline of Annual Research Achievements

2020年度はIn vitroにおける抗血液型抗体産生定量モデルにおけるリンパ球サブセットの解析の予備実験を行った。まずコントロール（ボランティア健常人）から末梢血を採血し、われわれが設定した培養条件（2.5%ヒトAB型血清、リコンビナントIL2、リコンビナントIL15を加えたAIMV培地）で培養し、細胞のサブセット解析をフローサイトメトリー法を用いて解析するための条件設定をおこなった。CD3、CD4、CD8をT細胞マーカー、CD19、CD20をB細胞マーカー、CD38、CD138を形質細胞マーカーとして解析するための染色条件並びにFCM設定についての至適条件を検討した。さらにPD-1、PD-2、PD-L1、 PDL2、CTLA4を共刺激因子マーカーとして、CD25、Fox3を制御性T細胞 マーカー、IL-10、CD5 CD1dhi TIM-1, IL-10産生能を制御性B細胞マーカーとしフローサイトメトリーによる解析条件設定を設定し、再現性を検討した。T細胞、B細胞マーカーの染色と条件設定は順調に進んだが、PD-1,PD-2,PD-L1,PD-L2,CTLA4などの共刺激分子マーカーの染色と条件設定には既存の論文報告記載の条件と抗体を適用しても適正な染色条件、検出解析条件設定を見出すのに時間を要した。
上記と並行してABO血液型不適合腎移植を既に受けた患者からリンパ球提供を受けるための研究計画書と患者説明同意文書を作成し本学の倫理委員会で審査を受けた。
2021年度は条件に該当する患者から末梢血を採取し、前記の健常人検体で設定した条件下での細胞解析を開始した。実験機器の数回の故障で実験が行えない時期があったこと、移植患者では免疫抑制薬投与によりリンパ球数が減少しており、十分な解析が行えない患者もおり再検査が必要な症例が多く、解析にやや難渋しているのが現状である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

コントロールの細胞を用いたT細胞マーカー, B細胞マーカーの染色とFCM条件設定はある程度標準的て一般的に普及した方法であることもあり、ほぼ順調に進んだが、PD-1,PD-2,PD-L1,PD-L2,CTLA4などの共刺激分子マーカーの染色とFCM条件設定については既存の論文報告に記載されている条件と抗体を使用しても適正な染色条件、検出解析条件設定を見出すのに時間を要した。2021年度は条件に該当する患者から末梢血を採取し、前記の健常人検体で設定した条件下での細胞解析を開始したが、移植患者では免疫抑制薬投与によりリンパ球数が減少しており、十分な解析が行えない患者もおり当初の予定通りのデータが得られず再検査が必要な症例が多く、解析にやや難渋しているのが現状である。また設置機器のフローサイトメーターが数回にわたり故障し修繕のため数ヶ月に渡り主実験が行えない時期があったことも報告する。

Strategy for Future Research Activity

PD-1,PD-2,PD-L1,PD-L2,CTLA4などの共刺激分子マーカーの染色とFCM条件設定については既存の論文報告の記載条件を再検討し適正条件を見出した。倫理委員会で承認を受けた対象患者の同意のもと提供していただいた患者リンパ球を対象として培養・抗体産生系を以前我々が実際におこなった実験系を用いて再現し、そのリンパ球集団についてT細胞・B細胞マーカーと共刺激分子マーカーの発現状況の解析を開始できているが、移植患者では免疫抑制療法の影響で末梢血リンパ球数が減少しており、解析に十分な細胞数を確保するのが難しい患者が少なくないことが判明した。しかし採血量を増やすことは医学的にも倫理的にも難しく、検査を分けて行ったり、時間を置いて再検査が必要な症例も少なくない。そのため全体的に研究の進捗が遅れているが検索のための適正条件はほぼ固まっており、引き続き対象症例の検体採取と解析を地道にすすめたい。

Causes of Carryover

本研究は以前我々が行ってきた研究を発展的に引き継いだ実験を基本として開始した。そのため最初に培養条件、フローサイトメトリー解析条件設定のための培養機器、ピペット、モノクローナル抗体等の消耗品は以前行っていた実験からの引き続き実験であった事等により充分量が既に確保されていたことに加え、実験条件の設定に時間がかかっていた時期に、既に当施設に設置されていて本実験に供する設備であったフローサイトメーターが数回にわたり故障し、修繕のために実験が一時期実施不可能な時期が数ヶ月間続いたこと（共同設備のため修繕には別予算を充当）などから、当初予定していた予算以下で研究が進行している。今年度は実験に必要な培養機材、モノクローナル抗体、フローサイトメーター関連の消耗品を順当に購入する必要性があるため予算は予定通り消化することになると思われる。

Research Products

• [Journal Article] A Novel Method of CD31-Combined ABO Carbohydrate Antigen Microarray Predicts Acute Antibody-Mediated Rejection in ABO-Incompatible Kidney Transplantation (2022)
  • Author(s): Masayuki Tasaki, Hiroaki Tateno, Takashi Sato, Azusa Tomioka, Hiroyuki Kaji, Hisashi Narimatsu, Kazuhide Saito, Yuki Nakagawa, Toshinari Aoki, Masami Kamimura, Takashi Ushiki, Manabu Okada, Yuko Miwa, Kiyohiko Hotta, Yutaka Yoshida, Kota Takahashi and Yoshihiko Tomita
  • Journal Title: Transplantation International Volume: 35 Pages: 1-13
  • DOI: 10.3389/ti.2022.10248
  • Peer Reviewed / Open Access