2021 Fiscal Year Research-status Report
ヒトiPS細胞由来テストステロン産生Leydig細胞の作製と臨床応用に関する実験
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20K09578
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
藤澤 正人 神戸大学, 医学研究科, 教授 (30243314)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
重村 克巳 神戸大学, 保健学研究科, 准教授 (00457102)
青井 貴之 神戸大学, 科学技術イノベーション研究科, 教授 (00546997)
石田 貴樹 神戸大学, 医学部附属病院, 特定助教 (10771850)
千葉 公嗣 神戸大学, 医学部附属病院, 講師 (40533766)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | Leydig細胞 / iPS細胞 / NR5A1 / テストステロン / Tet-OFF / アルギン酸ビーズ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒトiPS細胞からLeydig様細胞を分化誘導するにあたり、Leydig細胞への分化に必須のマスター遺伝子であるNR5A1を、これまではTet-ONシステムを用いて強制発現していた。しかしこのシステムではNR5A1を強制発現させるためにドキシサイクリンを加え続ける必要があるため、臨床応用に不向きだった。そのため今回我々は、Tet-OFFシステムによるNR5A1強制発現細胞の作製に着手し、これに成功した。これによりドキシサイクリン非依存性にNR5A1を発現できるようになったため、より臨床応用に適した細胞を得ることができた。
また、従来法で作製したLeydig様細胞はテストステロンの分泌力が弱く、細胞も40日程度で死滅してしまうという問題点があった。そこで今回、分化誘導の途中から浮遊培養を接着培養に切り替えることや、分化誘導初期に中胚葉指向性を高めるためにCHIR99021やBMP4、VEGFなどのサイトカインを添加することにより、従来法よりも高濃度のテストステロンを培地へ分泌し、さらに結果として120日以上も生存する細胞の作製に成功した。
こうして作製した細胞を免疫染色で確認したところ、Leydig細胞のマーカーであるHSD17B3、STAR、CYP17A1、CYP11A1の発現を認めた。特にHSD17B3はLeydig細胞に特異的なマーカーであるが、この陽性率は99%以上であり、極めて高い分化誘導効率を達成したといえる。
またscRNA-seqのUMAPでは、実際のLeydig細胞と非常に近似した位置に我々のLeydig様細胞は位置しており、またヒートマップでもほぼ同様の遺伝子発現状況を示した。
さらに、これらの細胞を培養皿から剥がし、免疫隔離デバイスであるアルギン酸ビーズ内に包埋した。このビーズに包埋した細胞を皿上で培養継続したところ、上清中へのテストステロンの分泌を確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
従来法よりも大量のテストステロンを分泌するLeydig様細胞を得た。また従来法で作製したLeydig様細胞は40日程度の寿命であったが、120日以上の寿命を持つ長寿なLeydig様細胞を作製することができた。これらの細胞はscRNA-seqや免疫染色で、実際のLeydig細胞と非常に近い遺伝子発現・タンパク質発現状況であるが確認できた。したがってin vitroにおいて、iPS細胞からLeydig細胞への分化誘導法の改善に成功した。またin vivoへの応用に向けて、このLeydig様細胞を免疫隔離デバイスへの包埋し、皿上で培養上清へのテストステロンの分泌を確認した。したがって当初の目標のうち、「免疫隔離系の確立と最適な免疫隔離処置細胞の培養方法を明らかにすること」は達成したといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
in vitroで作製に成功したLeydig様細胞を、今後は免疫不全マウスや薬剤去勢マウスに移植し、血清テストステロンが上昇するかどうかを確認していく。最終的には免疫系に異常のないSDラットに移植し低テストステロン血症が改善するかを検討する。
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| Causes of Carryover |
2022年度は動物実験をメインに行うため、研究を行うために必要な資金はこれまでの2年間よりも増えると予想している。今回の次年度使用額を用いて研究を行っていく。
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