腎癌幹細胞は腫瘍内不均一性を示すか？ー淡明細胞型腎癌の根源的治療法を求めてー

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K09582
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 近藤 慶一 横浜市立大学, 医学研究科, 客員准教授 (80363836)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: Renal cell carcinoma / Single cell

Outline of Annual Research Achievements

今年度も引き続き腎癌症例に対する手術（腎摘出術・腎部分切除術）で得られた組織の余剰検体からサンプリングを行い、Single cell化処理を行った。培養液中での細切過程は変更しなかったが、コラゲナーゼをベースとした酵素のカクテルの組成を変えることで可能な限り細胞塊を崩す工夫をおこない、Single cell化の効率の改善を図った。
しかし細胞塊を崩すために酵素処理時間などを変更することで昨年度も問題であったSingle cell化した細胞の培養下での生存率がかえって低くなってしまうという現象は未だ解決できておらず、培養液や培養環境を変更してみたが解析に十分な細胞量を継続的に収集することが難しい状態が続いている。そのため未だ培養下での複数種（癌・血管内皮・間質など）の細胞を用いた腫瘍内微小環境の再生までは踏み込めていない。そのため次年度も引き続き酵素カクテルの組成などの処理方法の改善並びにSingle cell化後の培養液や培養環境（ガス組成・温度など）の最適化を行い安定的なSingle cellからの培養技術の確立を目指す。
また予備実験として遺伝性腎細胞癌患者の手術標本から作成したSingle cellサンプルに対してNext generation sequencingをおこなった。組織型ごとに細胞組成の相違を観察したところ、Clear cell renal cell carcinoma（von Hippel-Lindau disease）とChromophobe renal cell carcinoma(Bert-Hogg-Dube syndrome)では予測されていたとおり血管系細胞の含有率には明らかな違いが認められた。さらに予想されていなかったこととして免疫系細胞の分布パターンにも違いが見られた。こちらについては現在論文投稿中である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

一昨年度からのCOVID-19の流行による研究の遅れがまだ影響している。

Strategy for Future Research Activity

依然としてSingle cellの回収率および生存性には高いハードルが存在しており、次年度以降の研究期間でも引き続きこれらの効率の改善を目指していく。
1.酵素カクテルの組成の最適化
2.細胞培養液の組成や培養環境（温度やガス組成）の最適化
3.回収率と生存率が改善された時点で３次元培養＋マーカーによる染色による幹細胞の回収技術の確立
これらの実験で腎癌幹細胞の検出が可能と考えられた段階で、pT1b以上の腎癌手術検体からMultiple site samplingを行い、幹細胞レベルでの不均一性の検証に進みたいと考えている。

Causes of Carryover

組織サンプルから作成したSingle cellからの培養技術確立後に最も費用が必要なNext generation sequenceを行う予定であり、研究がやや遅れていることから来年度以降に使用する。