人工卵巣を用いた新規不妊治療技術の開発

2022 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20K09629
• Research Institution: Saitama Medical University
• Principal Investigator: 赤堀 太一 埼玉医科大学, 医学部, 非常勤講師 (90573171)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高井 泰 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (60323549)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 卵子幹細胞

Outline of Annual Research Achievements

本研究は成人卵巣内に存在する卵子幹細胞を用いた生殖補助医療の実現を目指すものである。研究方法としては卵巣から抽出した卵子幹細胞、顆粒膜前駆細胞か ら人工卵巣組織を体外で構築する事が骨子である。この人工卵巣を用いて、卵子幹細胞に最適な微小環境を構築し生理的な卵子の分化誘導を行う。具体的な方法 としては凍結保存された卵巣組織を融解し、コラゲナーゼにて組織を溶解する。溶解した卵巣細胞懸濁液に一次抗体として抗DDX4抗体を反応させる。洗浄の後、 蛍光標識された2次抗体を用いてDDX4陽性細胞を標識し、FACSにて分離する。同時に、DDX4陰性細胞も回収する。分離された細胞は、ゼラチンコートあるいはMEF を播種した培養ディッシュに播種し、37°C、5%CO2 の環境下で培養する。はじめの7日間は、2日毎に培養液を少量追加し、以降は、コロニーを確認するまで2日 毎に培養上清を半量入れ替える。 このようにして人工卵巣作成に必要な細胞を分離培養する。これらの細胞を3次元共培養し、人工卵巣を構築する。2022年度 は、ウシ卵巣を用いた実験を継続してきた。ウシ卵巣から抽出された卵子幹細胞および支持細胞である顆粒膜細胞の機能確認のために、培養細胞のPCR法による 遺伝子発現の確認および、培養細胞の免疫蛍光染色による機能評価を行なった。卵巣組織から分離し、樹立した細胞の精度管理のため、複数回の実験を繰り返 し、最適な条件を設定した。これにより、安定して目的の細胞を分離培養する事ができるようになり人工卵巣を用いた卵子幹細胞の分化誘導実験 を行う準備が整っている。