2021 Fiscal Year Research-status Report
生理的・病的条件下でのHIF-２αによる栄養膜細胞のFlt1遺伝子発現機構の解明
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20K09675
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| Research Institution | Jobu University |
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Principal Investigator |
笹川 忠 上武大学, 医学生理学研究所, 研究員 (30424675)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | Flt1 / HIF-2α / HIF-1β / 妊娠高血圧症候群 / 栄養膜細胞 / 転写制御 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度、ヒト栄養膜細胞における低酸素誘導性Flt1遺伝子発現上昇にHIF-2α/HIF-1βが関わっていることを明らかにした。本年度では、これらが結合するFlt1遺伝子上に存在する低酸素応答性領域(HRE)を同定するためクロマチン免疫沈降シーケンス(ChIP-seq)を試みた。ヒト絨毛由来細胞株BeWoについて様々な市販抗体を用いてChIPを行なったが、NGS解析に供する断片化クロマチンDNAを必要量回収することができなかった。原因として、BeWo細胞がヒト単離栄養膜細胞と比べてFlt1遺伝子発現がかなり低かったことと購入した抗体がChIPにワークしなかった可能性が考えられた。本来、ヒト単離栄養膜細胞でChIPを行うべきだが、サンプル調製に必要な細胞数を得るのが難しいため、それに変わる細胞ソースの探索も行なった。その結果、ヒト栄養膜幹細胞(hTSC)より分化誘導させた合胞体性栄養膜細胞(STB)が有効であることがわかった。hTSCは増殖性が高いため細胞数を十分量確保でき、それを分化させたSTBはヒト単離栄養膜細胞と同様に低酸素刺激によるFlt1遺伝子発現の上昇およびsFlt1タンパク質産生の増強も確認できた。さらに、siRNAや阻害剤を用いた検討により、以上の事象にもHIF-2α/HIF-1βが関与することが明らかとなった。このことから、hTSC由来STBを用いることで生体を反映したFlt1遺伝子の機能的HREを同定できる可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
ChIPの条件検討およびヒト単離栄養膜細胞に変わる細胞ソースの探索にかなりの時間を費やしたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
HIF-2α/HIF-1βが結合するFlt1遺伝子の機能的なHREを同定するため、引き続きChIPの条件検討を行う。加えて、免疫沈降が必要でないCUT&RUN assayやCUT&Tag assayなどの手法を用いた検討も平行して行う。解析によって得られたHREの関与の確認には、ゲノム編集による欠失または変異を施したhTSCを作製し、STBに分化させた後、低酸素刺激でのFlt1遺伝子発現を評価する。
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