2021 Fiscal Year Research-status Report
デルタ型グルタミン酸受容体の異常による内耳synaptopathyの病態解明
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20K09727
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
藤川 太郎 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (60401402)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 加齢性難聴 / グルタミン酸受容体 / デルタ型受容体 / 有毛細胞シナプス / Synaptopathy |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究はシナプス形成と維持に重要なデルタ型グルタミン酸受容体の欠損マウス（GluD-KO）の難聴発症機構を解明することを目的としている。デルタ型グルタミン酸受容体は内耳に高発現し、過大音響刺激に対する脆弱性と高音障害型難聴を示すことが知られている。我々はGluD1-KOの表現型解析を行ったところ、3か月齢では難聴を示さないが、その後高音域から始まる進行性の難聴を示すことがわかった。また組織学的解析でははやり3か月齢では明らかな変化は見られなかったが、その後全周波数域で外有毛細胞遠心性シナプスが進行性に変性・消失し、遅れて外有毛細胞自体が失われていくことがわかり、これは表現型とよく一致していた。GluDの同シナプスでの局在を知るために免疫組織化学を行ったところ、GluD1の外有毛細胞遠心性シナプスでの発現が確認された。さらにGluD1と複合体を形成してシナプスの形成に与るcerebellin 1(Cbln1)が同シナプスのシナプス間隙に局在を認めた。興味深いことにGluD1-KOでもCbln1の発現が消失しなかったことからGluD2の代償的な発現の可能性を考え、GluD2の免疫組織化学を行ったところ、やはりGluD2も外有毛細胞遠心性シナプスでの発現を認めた。さらにコルチ器組織を用いた定量PCRでGluD1とGluD2の発現量の代償関係があることが確認された。以上の結果から、GluD1が蝸牛においても重要な働きをしており、外有毛細胞遠心性シナプスの形成と維持に必要であることが示唆された。またGluD2はその機能を不完全に代償し、3か月までは外有毛細胞遠心性シナプスを維持できるが、その後はCbln1の慢性的な活性化によるactivity-dependent plasticityが生じてシナプスが維持できなくなる可能性がある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
GluD1-KOの表現型と形態学的変化の関連についてはほぼ解析が終了し、GluD1-KOの難聴の病態として、外有毛細胞遠心性シナプス不全による加齢性難聴が明らかとなった。とくにGluD1の免疫組織化学は長年の懸案であったが、glyoxal固定を用いることでようやく妥当な染色像が得られたことは大きな進展で合った。またGluD1とGluD2の代償関係を明らかにするためにコルチ器組織を用いた定量PCRを行った。問題点として適切なプライマーの選択と発現量が少ないことに起因する増幅の難しさがあった。プライマーは既報告のものを複数検討し、最適な増幅ができるプライマーを選択した。またプリアンプを用いてcDNAライブラリーで定量の対象だけを等量であらかじめ増幅することで、発現量の少なさを克服することができた。以上の成果は2021年10月に第31回日本耳科学会の公募テーマセッションで口演した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の課題として３つ挙げられる。第1にGluDとCbln1の機能的関連である。GluD1ないしGluD2がCbln1と結合して外有毛細胞遠心性シナプス形成を行うことを示すために、現在GluD1/GluD2ダブルKOを作成して、形態学的解析が進行中である。第2にCbln1の起源である。一般にはCblnはシナプス前細胞から分泌される。しかし脳幹での形態学的解析の結果、外有毛細胞遠心性シナプスの起源である上オリーブ蝸牛核にはCbln1の発現がみられなかった。そこで蝸牛の支持細胞からの発現の可能性を考えて、HA-Cbln1タグマウスを用いて形態学的解析が進行中である。第3にGluD1がポスト側である外有毛細胞での局在を示すことである。海馬組織でpre-embeddingによる免疫電顕の報告があり、蝸牛への応用を現在すすめているところである。
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| Causes of Carryover |
少額が次年度に繰り越しとなったが、これはコロナ禍で海外の学会参加や発表の機会がなかったためである。論文投稿費用として使用の予定である。
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