2020 Fiscal Year Research-status Report

急性感音難聴の遺伝子医療に向けた、内耳におけるマスター転写因子の実験研究

Research Project

Project/Area Number	20K09756
Research Institution	Okayama University
Principal Investigator	高原潤子岡山大学, 医学部, 技術専門職員 (80448224)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	前田幸英岡山大学, 大学病院, 講師 (00423327)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	蝸牛 / 音響外傷 / Atf3 遺伝子 / 次世代シークエンサー / RNA-seq / リアルタイムRT-PCR
Outline of Annual Research Achievements	2020年度中までに、音響外傷により急性感音難聴を発症したマウスの蝸牛で、転写因子Atf3（Activatinng Transcription　Factor3）の発現変化を検討した。Atf3については、内耳以外の組織ではすでに、炎症・免疫関連遺伝子群の発現をコントロールすると報告されている。急性感音難聴発症12時間後の蝸牛では、炎症性サイトカインなど、免疫・炎症機能に関連する多数の遺伝子群が変動する。それに先立って、難聴発症3時間後の蝸牛局所でのAtf3発現量は、騒音にさらされていないコントロールに比べて、次世代シークエンサー(RNA-seq)では2.351倍、DNAマイクロアレイでは2.082倍に増加していた。これらのデータを確認するため、より定量的な実験としてリアルタイムRT-PCRをおこなった。リアルタイムRT-PCRでは難聴発症3時間後の蝸牛では、Atf3発現量は8倍以上に著増していた（8.44±0.31 vs 1.01±0.20 Mean±S.D.,n=6, P<0.01 by t-test）。また難聴発症12時間後にもAtf3発現量はRNA-seqでは3.105倍、DNAマイクロアレイでは3,753倍に増加していた。リアルタイムRT-PCRで確認したところ、難聴発症12時間後の蝸牛でも、Atf3発現量は10倍以上に著増していた（13.3±1.35 vs 1.00±0.04,P<0.01,n=6）。また免疫染色法で、難聴を発症した蝸牛内でのAft3の発現部位を確認したところ、難聴発症3時間後、12時間後ともに、コルチ器でのAtf3蛋白発現を認めた。この際、コルチ器の支持細胞と有毛細胞の両者でAtf3の発現をみとめたが、有毛細胞での発現は12時間後の方がより明確であった。これまで、音響外傷を発症したマウスの蝸牛での炎症・免疫反応はらせん靭帯や、らせん板縁を中心におこると報告されていたが、今回の実験で、コルチ器の有毛細胞・支持細胞でもその様な炎症・免疫反応がおこることが明らかになった。以上の研究結果は、2020年度の日本耳鼻咽喉科学会総会や、日本聴覚医学会で報告した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当研究の交付申請書に記した、当研究の目的は、急性感音難聴発症時のマウスの蝸牛において、炎症・免疫関連遺伝子を中心的に制御する転写因子（マスター転写因子）を探索・同定することであった。また特に、炎症・免疫反応をコントロールする転写因子であるAtf3遺伝子などに注目した解析を行うことであった。2020年度中までに当初の研究計画にそって、急性感音難聴を呈したマウスの蝸牛で、RNA-seq、DNAマイクロアレイ、リアルタイムRT-PCRによる遺伝子発現解析を行い、難聴発症後3時間および12時間の蝸牛でAtf3の発現量が、コントロールの蝸牛に比べて著増することを明らかにした。また難聴発症後3時間および12時間の蝸牛でのAtf3の発現部位はコルチ器の有毛細胞・支持細胞であることを明らかにした。またさらに、感覚細胞である有毛細胞でのAtf3発現は、難聴発症3時間後よりも、12時間後の方が明確であると明らかにした。すでに転写因子Atf3は蝸牛以外の組織では炎症・免疫反応に関係する遺伝子群を制御することがしられている。これらの成果により、難聴発症3、12時間後のコルチ器有毛細胞、支持細胞において、Atf3は炎症・免疫反応の遺伝子発現をコントロールしていると考えられる。この現象は、蝸牛の感覚細胞における炎症・免疫反応として重要である。臨床的にもATF3の特定の遺伝子多型を持つ者は、喘息の発症リスクが高いと報告されており、難聴の発症リスク予測法や、ステロイド等による合理的な治療モデルを開発する上でも、有用な成果と考えられる。2020年度にはこれらの研究結果や意義を、学会発表などにより報告することもできた。従って、当研究は現在までにおおむね順調に進展していると自己評価した。
Strategy for Future Research Activity	今後は引き続き交付申請書に記した研究計画に基づき、音響外傷により急性感音難聴を呈したマウスの蝸牛においてStat4(Signal transducer and activator of transcription 4)の発現を解析する。Stat4も、Atf3と同様に内耳組織以外では炎症・免疫反応を制御することが知られる転写因子である。急性感音難聴発症早期（24時間以内）のマウスの蝸牛組織において遺伝子発現解析を行い、Stat4の発現が難聴発症時の蝸牛でどの様に変化しているか検討する。またその際、抗Stat4抗体を用いた免疫染色法で、蝸牛のどの様な構造で発現がみられるか検討する。これにより難聴発症時の蝸牛組織で転写因子Stat4がいかに炎症・免疫反応の遺伝子群を制御しているか考察する。次段階の実験では、Atf3、Stat4、以外にも難聴発症時に蝸牛組織で遺伝子発現を制御していると考えられる転写因子群のリストを作成する。我々のこれまでの検討では、難聴発症時の蝸牛で炎症・免疫関連遺伝子群が変動するのは、主に12時間経過後であった。そこでより早期の難聴発症3時間後に、RNA-sea、DNAマイクロアレイの網羅的データに基づき、蝸牛で発現量が変動する遺伝子群の網羅的リストを作成する。これらの遺伝子の機能をweb上の遺伝子機能解析データベースである、David Bioinformatics Resources （https://david.ncifcrf.gov/)で解析して、転写因子をコードする遺伝子群が変動していないかどうか検討する。特定の転写因子が変動すると判明した場合は、リアルタイムRT-PCRでより定量性の高いデータを取得し、これら転写因子群群が難聴発症の際に変動していると示す。これにより急性感音難聴発症時のマウスの蝸牛において、炎症・免疫関連遺伝子を中心的に制御する転写因子（マスター転写因子）を探索・同定する。
Causes of Carryover	2020年度の予算は前倒し請求した分もふくめて、難聴モデルマウスの作成、RNA-seq、DNAマイクロアレイ、リアルタイムPCR、免疫染色などの実験に必要な費用、およびリアルタイムRT-PCR機器の老朽化にともなう買い替えの費用として見積もったものである。研究実績や進捗状況の項に記した様に、これらの実験は計画通りおこなわれた。有意義なデータも比較的スムースに得られ、反復実験なども必要なかったので次年度使用額が生じた。 2021年度にも引き続き、“今後の研究の推進方策“にしめした計画にしたがって、難聴モデルマウスを用いた遺伝子発現実験をおこなう。研究経費はマウスの購入・飼育費用、RNA-seq、DNAマイクロアレイ、リアルタイムRT-PCR、免疫染色などの実験に必要な経費として用いる。また遺伝子・蛋白発現解析のデータ処理に必要な、パーソナルコンピューター一台を購入することを計画する。