2021 Fiscal Year Research-status Report
エピゲノム編集による抹消血を用いた網膜色素変性病因遺伝子の発現解析法の開発
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20K09765
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
西口 康二 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (30447825)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中澤 徹 東北大学, 医学系研究科, 教授 (30361075)
藤田 幸輔 名古屋大学, 医学系研究科, 助教 (80708115)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 網膜色素変性 / ゲノム編集 / リンパ球 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、網膜色素変性患者由来の不死化リンパ球を対象に、ゲノム編集技術を用いて特定のRP病因遺伝子のプロモーターを非メチル化することにより同遺伝子の強制発現細胞株の樹立を可能にする技術を開発することを目的とした。まずは日本人網膜色素変性患者の病因遺伝子として最も頻度が高いEYS遺伝子を開発対象とした。同遺伝子のプロモーター配列をゲノム編集を用いて非メチル化したところ、それ単独ではEYS発現は誘導されなかった。しかし、この細胞に対して脱メチル化剤を添加することによってEYS発現が検出された。我々はさらに効率的な手法を樹立する目的でCRISPR activationを用いた遺伝子強制発現法の開発に着手した。
EYS転写開始点をカバーするようにgRNAを複数デザインし、それらをCRISPR activationに用いた。この方法でHEK293Tやリンパ芽球でEYSの発現の誘導に成功した。
我々は、患者由来のリンパ芽球細胞株を用いて、本来リンパ球では発現しない網膜色素変性病因遺伝子のmRNA発現解析を行い、同患者のゲノム情報と照合することにより、逆算的に病因変異の同定可能であることを確認した。このアプローチの基本的有用性が明らかになったため、この方法を改良することで比較的簡便かつ安価な遺伝子診断補助検査法の開発を目指している。具体的には、末梢血から単核球分画を分離し、CRISPR activationを用いてそれらの細胞でEYSの遺伝子発現解析を行う。現時点では、分離した単核球に対して蛍光遺伝子を導入し、培養条件を設定中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
患者由来リンパ芽球でプロモーターを非メチル化したうえで脱メチル化剤を投与すると、EYS発現が誘導された。この手法でもEYS変異解析が可能であることは確認されたが、リンパ芽球の樹立や、プロモーターの非メチル化細胞株のクローンを樹立し、薬剤を投与する必要がある点でスクリーニング系としては簡便さに欠けるなどの問題点がある。
それに対して、患者由来リンパ芽球でCRISPR activationによりEYS発現誘導に成功した。現在、患者由来リンパ芽球の樹立を必要としない、末梢血を用いたCRISPR activationによるEYS発現法の開発に着している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後、末梢血を用いたCRISPR activationによるEYS発現に成功した場合、既知のEYS変異を有する患者の末梢血を用いて、mRNA解析を介して簡便かつ逆算的に変異の同定が可能かを検証する
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| Causes of Carryover |
概ね予算内で研究が執行された。しかし、予定していた一部の実験内容が変更になったのに伴って次年度使用額が生じた。
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[Journal Article] A hypomorphic variant in EYS detected by genome-wide association study contributes toward retinitis pigmentosa2021
Author(s)
Nishiguchi KM, Miya F, Mori Y, Fujita K, Akiyama M, Kamatani T, Koyanagi Y, Sato K, Takigawa T, Ueno S, Tsugita M, Kunikata H, Cisarova K, Nishino J, Murakami A, Abe T, Momozawa Y, Terasaki H, Wada Y, Sonoda KH, Rivolta C, Tsunoda T, Tsujikawa M, Ikeda Y, Nakazawa T
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Journal Title
Commun Biol
Volume: 4
Pages: 140
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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