2020 Fiscal Year Research-status Report
シナプスタンパク質CAST/ELKSの欠損による網膜変性の作用機序解析
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20K09769
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| Research Institution | University of Yamanashi |
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Principal Investigator |
萩原 明 山梨大学, 大学院総合研究部, 准教授 (70402849)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 網膜 / 水平細胞 / リボンシナプス / 視覚機能 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
＜研究の目的＞
網膜は外界からの光情報を脳に伝える重要な感覚器の一つであり、申請者はこれまでにシナプスタンパク質CAST/ELKSを欠損させたマウスの網膜において視覚機能の低下に視細胞リボンシナプスの異所性局在が相関することを明らかにした。また電子顕微鏡の３次元立体再構築法を用いた、リボンシナプス・双極細胞・水平細胞が構築するTriad構造の形態学的解析からは、視覚機能の低下の要因となるリボンシナプスの長さが有意に短くなっているだけでなく、特徴的な形態変化として水平細胞の分岐も有意に低下していることを見出した。本研究では、異所性局在をはじめとして網膜神経回路が変性するメカニズムをより詳細に解析し、網膜変性疾患の原因解明や治療法開発に貢献することを目的としている。
＜２０２０年度研究実施内容＞
先の電子顕微鏡による形態学的解析によって(Hagiwara et al., JCB, 2018)、視細胞からのシナプス伝達や網膜神経回路の調節に水平細胞からの抑制性入力が重要な役割を担っていることが示唆されたことから、本研究計画ではまずCAST/ELKSをはじめとする各種神経伝達関連タンパク質の水平細胞特異的な欠損マウスを作成し解析することとした。CAST, ELKS, およびCAST/ELKSを水平細胞特異的に欠損させたマウスの網膜を解析したが、視細胞リボンシナプスに顕著な異所性局在は認められなかった（投稿準備中）。このことから、CAST/ELKS欠損マウスでは、視細胞リボンシナプスからの入力低下が水平細胞を変性させていることが示唆された。
また、網膜神経細胞の動態観察に向けた各神経細胞の特異的な標識法に関しては、網膜にAAVを感染させる方法を確立し、現在セロタイプや細胞特異的プロモーターなどの検証を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
＜シナプスタンパク質の水平細胞特異的欠損マウスの解析＞
視覚機能の低下と相関することが示唆されている視細胞リボンシナプスの異所性局在を指標として、シナプスタンパク質CAST, ELKSの水平細胞特異的欠損マウスの網膜の形態学的観察を行った。その結果、これらのマウスでは顕著なリボンシナプスの異所性局在が認められず、先のCAST/ELKS欠損マウスで見られた水平細胞の変性は視細胞からの入力依存的な形態変化であることが示唆された。
＜網膜神経細胞の動態観察＞
網膜・神経細胞の動態をライブイメージング法で解析するため、まずは網膜を構成する各種神経細胞を蛍光タンパク質によって標識する方法を構築している。アデノ随伴ウィルス(AAV)を用い、網膜の神経細胞を標識する方法を構築し、現在はAAVのセロタイプや発現ベクターのプロモーターの検討を行っている。水平細胞への標識には、各種シナプスタンパク質の欠損マウスの作成で用いたCx５７-CreマウスにCre依存的に発現するFlex型のAAVが有用であることがわかった。一方、視細胞からのシナプス伝達を受け取り、次の神経節細胞へと情報を伝達する双極細胞に関しては、プロモーターの改良などを含め現在も検証を続けている。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究申請者は、２０２１年度より東京理科大学・理工学部・応用生物科学科に異動し、申請当初の研究体制は共同研究という形で継続させながら、独立して研究を進めていく。このため、２０２１年度は実験設備の立ち上げや所属する学生らを指導しながら本研究を下記のように推進していく。
＜シナプスタンパク質の水平細胞特異的欠損マウスの解析＞
本研究課題では、先の研究を発展させる形でCASTとELKSを中心に水平細胞特異的な欠損マウスを作成し、網膜の形態学的解析を行った。その結果、水平細胞のCASTやELKSは視細胞の異所性局在や視覚機能への影響は低いことがわかったが、一方で水平細胞は視細胞から双極細胞へのシナプス伝達を抑制的に調節する重要な役割を担っている。今回使用したCx５７-Creマウスは水平細胞特異的な欠損マウスの作成に有用であることがわかったため、今後他のシナプスタンパク質をはじめ各種floxマウスと交配を行い、網膜神経回路における水平細胞の機能解析や視覚機能との関係をより詳細に解析する研究へと発展させる。
＜網膜神経細胞の動態観察＞
網膜の神経細胞はそれぞれ特徴的な形態と分子を発現していることから、特異的なプロモーターを利用した発現ベクターで、蛍光タンパク質や蛍光膜電位センサー等を発現させることが望ましい。このため、プロモーターの種類や改良などを今後も継続し、より効率的に発現するベクターの探索を行う。
また、Cx５７-Creマウスを用いることで、Cre依存的な発現ベクターで水平細胞を標識する方法が構築できてきたことから、今後はライブイメージング法のセットアップも具体的な検討を進めていく。
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| Causes of Carryover |
本研究申請者は、２０２１年度より東京理科大学・理工学部・応用生物科学科で独立して研究室を運営することとなった。このため、２０２１年度には研究室の立ち上げに伴う備品や消耗品の購入が見込まれたため、２０２０年度の研究費の一部を２０２１年度に繰り越すこととした。
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Research Products
(1 results)
