三次元再生涙腺構造の誘導と新規バリデーション手法の開発

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K09780
• Research Institution: Tokyo Dental College
• Principal Investigator: 平山 雅敏 東京歯科大学, 歯学部, 助教 (90528473)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 涙腺 / ドライアイ / 再生医療 / 細胞外小胞 / 涙液

Outline of Annual Research Achievements

涙腺は涙液を眼表面に分泌することで眼表面上皮の恒常性を維持する。涙液中には水分だけでなく、涙液タンパク、電解質、サイトサインなどの液性因子を含み、涙液機能を持つと考えられる。これまで、涙腺機能の再生を目指して、涙腺組織再生による涙液機能を再建する技術開発が進んでいる。再生涙腺の機能評価において、涙液量や眼表面の状態の評価の他、涙液の質を評価する技術が求められている。
本研究では、三次元涙腺再生医療の進展を目指して、涙腺再生手法とその新規バリデーション手法の確立を目指して、前期、涙腺における液性因子のひとつである細胞外小胞の存在とその役割について解析をした。マウスより麻酔下において涙液を採取し、超遠心法にて細胞外小胞を分離し、電子顕微鏡下にて観察を行った。また、ウェスタンブロッティング法にて細胞外小胞マーカーの発現を確認した。さらに、マウス培養角膜上皮細胞に細胞外小胞を添加し培養したところ、角膜上皮細胞において恒常性にかかわる可能性が示唆された。
今期においては、将来の涙腺再生医療における新しい涙腺機能のバリデーション手法の確立を目指して、涙液に存在する細胞外小胞のさらなる機能解析を進めると同時に、涙腺組織再生を目指した新しい手法の開発を開始した。まず、これまでに行った涙腺発生において胎生期涙腺上皮細胞で発現が増加する転写因子を明らかとするために、同じ胎生期結膜上皮での遺伝子発現と比較して有意に増加する遺伝子群を解析した。また、涙腺発生の場として、角結膜細胞を起源とするオルガノイドを形成する技術を開発した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

培養角膜上皮細胞に分離されたエクソソームを導入したところ、細胞に取り込まれる像が観察可能であり、導入された細胞において、コントロール細胞と比較してKi67またはBrdU陽性細胞がコントロール群と比較して有意に増加した。さらに、導入細胞における遺伝子発現変化を解析するために、導入細胞とコントロール細胞のマイクロアレイ解析を施行した。
遺伝子発現解析では、導入細胞において513遺伝子の発現増加を認めた。これらの発現増加遺伝子の機能解析を施行したところ、cell cycle, cell membrane, transmembrane, cytoskeleton/microtubule, glycoprotein and signal peptideに関する遺伝子群が有意に増加していることが明らかとなった。このことから、前年度の結果と統合して、涙液中の細胞外小胞が、in vitroでの培養角膜上皮細胞において、生理的恒常性維持に関与する可能性が示唆された。

Strategy for Future Research Activity

本研究では計画通り、涙液中における新しい因子である細胞外小胞の機能解析の手法と評価方法を確立することができた。最終年度では、涙腺組織再生における新しい手法であるダイレクトリプログラミングを用いた涙腺再生の可能性を追求し、再生された組織や分泌涙液をこれまで確立したバリデーション手法を用いて検証する。

Causes of Carryover

次年度は最終年度であり、研究計画に沿って使用する