2020 Fiscal Year Research-status Report
低リスク網膜再生を実現する内在性幹細胞活性化－CRMP群のリン酸化制御－
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20K09790
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
徳田 和央 山口大学, 医学部附属病院, 助教 (50266863)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
清木 誠 山口大学, 大学院医学系研究科, 教授 (50226619)
藏滿 保宏 北海道医療大学, 医療技術学部, 教授 (50281811)
木村 和博 山口大学, 大学院医学系研究科, 教授 (60335255)
徳田 信子 獨協医科大学, 医学部, 教授 (70227578)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | CRMP / リン酸化制御酵素 / 網膜再生 / 内在性幹細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
低濃度のグルタミン酸により網膜の内在性神経前駆細胞を活性化し、活性化時の代謝関連因子、エネルギー代謝因子や制御にかかわる環境因子を解析して報告を行った。前駆細胞活性化時、特異的に発現が変化するタンパク質群があり、その中には複数の解糖系酵素がみられた。これらの解糖系酵素のうち、一部の酵素は非酵素的作用を有し、細胞質から核内に移行して、転写調節や発現調節、細胞分化の制御ならびに代謝制御のフィードバックや代謝リプログラミング機構に関与していた。これらの作用は、複数の因子群内の特定の因子が、さらに上流に位置する別の因子と相互的に作用することで生じることが示された。
また、研究計画内の失明モデルとして使用を予定している加齢黄斑変性モデルの導入準備を行った。Myocardin-related transcription factor A（MRTF-A）およびレチノイン酸受容体作動薬の一つであるRetinoic acid receptor alpha（RAR-α）について、線維芽細胞などの非免疫系細胞が関与する免疫応答や線維性増殖・線維化瘢痕制御などの観点から、これら因子のメカニズムを含む作用機構を検討し、結果を報告した。この報告では、液性因子を中心とした細胞間ネットワークと細胞外基質に焦点を絞り、解析を行った。
さらに、変性したタンパク質、熱ストレスへの対応に関与する熱ショック転写因子（heat shock transcription factor、HSF）HSF1にも着目し、網膜を構成する細胞群への作用を検討・解析して、報告を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
低濃度のグルタミン酸による内在性網膜前駆細胞の活性化を行い、活性化時に特異的に発現するタンパク質群を明らかにし、エネルギー動態の内、糖代謝および核酸代謝の動態変化を解明している。内在性網膜前駆細胞活性化時には、複数の解糖系酵素の発現が上昇し、そのうち一部は核内へ移行して転写調節に関与することが判明した。この因子は、酵素として作用する濃度以下で転写発現に関与しており、非酵素的作用を有していた。さらに、この因子の制御の上流に位置する別の因子と相互作用しながら、特異的な機能を発現していることが明らかになった。これらの結果をもとに、網膜前駆細胞の維持に関与するエネルギー動態関連タンパク質の解析を進めている。
グルタミン酸によって誘導される内在性網膜幹細胞は、免疫染色によりミュラー細胞マーカーと共局在を示すことから、成熟ラット網膜からミュラー細胞のみを安定して培養する、多孔多層質膜を用いたシステム（3D細胞培養システム）を構築し、実験計画を進めている。
さらに、失明モデルである加齢黄斑変性モデル動物での実験の一環として、網膜色素上皮の炎症、変性や上皮間葉移行などにかかわる因子群、細胞間ネットワークの検討を行い、その結果の一部を報告している。
以上のことから、実験計画は概ね順調に進んでいると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究計画書に従い、網膜再生を実現する内在性網膜幹細胞活性化の確立を目指し、次のステップを進める。
自己網膜再生能を有するZebrafishにおいて、これまで報告してきた内在性網膜前駆細胞活性化に関与するタンパク質群の発現制御を行う。すなわち、一過性に発現過剰や発現阻害を行い、計画書に示した条件での検討ならびに解析を行う。
また、リン酸化部位の解析に関しては、まずセルソーターを用いて細胞の選別を行い、質量分析によりタンパク質の解析を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
理由：当初の予定より、モルフォリノアンチセンスオリゴの設計、合成、導入費用を抑えることができた。また、研究内容を報告する専門学会や研究の打ち合わせがオンラインで行われたため、2020年度の旅費経費がなかった。これらの理由により、次年度使用額が生じた。
使用計画：質量分析によるタンパク質解析を行うため、機器設備の使用料や、使用する機器に対応した解析関連試薬の購入に使用する予定である。
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