遺伝性角膜疾患に対する遺伝子治療実現のための基盤技術の確立

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K09808
• Research Institution: International University of Health and Welfare
• Principal Investigator: 臼井 智彦 国際医療福祉大学, 医学部, 主任教授 (80282557)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 遺伝性角膜疾患 / 遺伝子治療

Outline of Annual Research Achievements

令和２年度はマウスを用いて、clustered regularly interspaced short palindromic repeat(CRISPR)- CRISPR-associated 9 (CRISPR-Cas9) システムと非相同性末端結合（non-homologous end joining, NHEJ）による遺伝子導入により、ターゲットとなる遺伝子の発現抑制がin vivo角膜において可能であるかの検討を行った。この研究を行うため、green fluorescein protein（GFP）マウスを用い、角膜においてGFP発現が抑制可能か検討することとした。そこでまずGFP遺伝子の発現をCRISPR-Cas9とNHEJでノックアウトするレンチウイルスベクターのコンストラクト作製に着手した。次に作製したGFP発現抑制ウイルスベクターの角膜におけるデリバリーの検討を行った。デリバリー方法としては、点眼、角膜実質内注射、輪部注射（輪部付近結膜下注射）を試し、効果的なデリバリーの検討を行った。観察は蛍光実体顕微鏡と組織切片両方で評価した。すると点眼では角膜において全くGFPの発現抑制は見られなかった。角膜実質注射は、角膜実質細胞での発現抑制効果は認めるものの、発現抑制部位はまだらであり、角膜実質全体の発現抑制は難しいことがわかった。また実質注射では角膜上皮においてはGFPの発現抑制効果はほとんど見られなかった。一方角膜全周の輪部の結膜下に注射した群では、角膜全体diffuseにGFPの発現の抑制が確認され、組織においても角膜上皮、実質共にモックトランスフェクションと比較して明らかにGFPの発現抑制を認めた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

マウス角膜においてCRISPRによるターゲット抑制するウイルスベクターのドラッグデリバリー方法の基礎的条件を得ることができた。この結果は令和３年度の検討に直結し、現在検討を進めている。
ただし、TGFBI角膜ジストロフィマウスの飼育にいくつかトラブルが生じたことや、コロナ禍で物理的に研究の進行し支障があり、創傷治癒の検討については行うことができなかった。

Strategy for Future Research Activity

本年度（令和3年度）は、予定通り、CRISPR-Cas9＋NHEJでTGFI遺伝子をノックアウトするレンチウイルスベクターの作製を行い、完成後LCD1マウスの角膜局所に遺伝子導入を行う予定である。TGFBIの発現抑制の確認はRT-PCRやwestern blottingで行う予定である。さらにTGFBI発現抑制レンチウイルスベクター遺伝子導入による、LCD1マウスの角膜混濁抑制効果についての検討も予定している。

Causes of Carryover

学会がほとんどなくなり、交通移動費などが使用されなかった。またコロナ禍で研究が進まない事項もあった。