RNA結合タンパク質Quakingによる網膜初期発生の分子機構の解明

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K09839
• Research Institution: Ritsumeikan University
• Principal Investigator: 森藤 暁 立命館大学, 薬学部, 助教 (20647234)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小池 千恵子 立命館大学, 薬学部, 教授 (80342723) ; 川村 晃久 立命館大学, 生命科学部, 教授 (90393199)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 網膜 / Quaking / 3次元網膜

Outline of Annual Research Achievements

CRISPR/Cas9法により、マウスES細胞株で、Qkiノックアウトクローンを1クローン単離することができた。タンパク質、DNAの回収を行い、ウエスタン解析・シークエンス解析によってQki遺伝子の破壊の確認を行ったところ、このクローンにおいてQkiのノックアウトが確認された。この株においては、細胞増殖能は、野生型と同様で、NanogやOct4といった幹細胞の未分化マーカーが発現していることから、この株は未分化維持されており、通常のES細胞と同様に増殖することが分かった。このQkiノックアウトクローンを3次元網膜に分化させたところ、初回は、網膜様構造への分化が停止するという表現型を得たが、2回目以降は、網膜様構造が観察され、野生型細胞が混入したためなのかなど、3次元網膜の表現型についてはっきりとした結論がだせていない。このため、別のQkiノックアウトクローンの単離を行うことにした。現在、別のQkiノックアウトクローンの単離中である。また、Qki KOマウスを理研BRCより入手した。Qki KOマウスは、胚性致死であるが、致死になるE9.5-E10.5における眼の表現型については報告されていないため、現在凍結切片により、E9.5でのQki KOマウスのホモ個体の眼について調査している。さらに、海外の研究者より、Qki floxマウスを取り寄せており、近日中にマウスの清浄化が終わるため、動物施設に搬入し、解析を開始する予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

単離できたQkiノックアウトクローンの3次元網膜の表現型がはっきりと確定できなかったため、再度、Qkiノックアウトクローンを単離することにした。このため、研究進捗状況について、やや遅れていると判断した。

Strategy for Future Research Activity

引き続きQkiノックアウトクローンの単離を行う。もし、野生型とQkiノックアウトクローンについて、3次元網膜の表現型の差がみられるようであれば、Qki cDNAの過剰発現により、表現型が回復するかどうかを調べ、RNA-seq解析により、どのような遺伝子群の発現に差がみられるのかを解析する。Qki KOマウスについてE9.5でのQki KOマウスのホモ個体の眼の表現型の解析を実施する。さらに近日中に到着するQki floxマウスとDkk3-Creマウスを交配し、網膜前駆細胞で特異的にQkiを欠損させた網膜の表現型の解析を行う。

Causes of Carryover

海外からのQki floxマウスの輸送に時間がかかり、このマウスの清浄化が年度内に終了しなかったため、清浄化に必要な関連費用の支払いが次年度になり、次年度使用額が生じた。現在新たなQkiノックアウトクローンの単離を行っており、3次元網膜の表現型に差がみられれば、レスキュー実験やRNA-seq実験を行うため、ES細胞株の培養や3次元網膜作製のための細胞生物学的実験費用、プラスミド作製やレンチウイルス作製のための分子生物学的実験費用、RNA-seq解析のための受託費用などに使用する予定である。