2021 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of skin fibrosis suppression mechanism by miRNA targeting
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20K09854
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| Research Institution | Toho University |
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Principal Investigator |
藤澤 千恵 東邦大学, 医学部, 講師 (10393000)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
林 明照 東邦大学, 医学部, 教授 (30218557)
赤坂 喜清 東邦大学, 医学部, 教授 (60202511)
深澤 由里 東邦大学, 医学部, 講師 (90392331)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 創傷治癒 / micro RNA / bFGF |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2020年度までに培養線維芽細胞においてBasic fibroblast growth factor (bFGF)により誘導されたmicroRNA 146b-5p(miRNA 146ｂ-5p)がPlatelet-derived growth factor receptorα (PDGFRα)を標的とし、その発現を制御することで、瘢痕形成時における線維化を抑制する可能性を示した。
2021年度はin vivoにおいてmiRNA146b-5pがin vitro同様に線維化を抑制するかを確認するため、創傷治癒へのbFGF添加が瘢痕形成へ与える影響について検討した。SDラット創傷部へのbFGF添加によりmiRNA146b-5p発現が脂肪組織周辺のエクソソーム内および線維芽細胞様細胞にて確認された。創傷部へbFGFとmiRNA146b-5p inhibitorを添加するとmiRNA146b-5pの減少、PDGFRα、collagen I、IIIおよびIV mRNAの増加が認められた。また、血管内皮細胞マーカーであるCD34およびCD31mRNAの増加も認められた。bFGFとmiRNA146b-5p mimicを添加するとこれらの発現は減少した。これらのことからbFGFはmiRNA146b-5pを誘導することによりPDGFRαの発現を抑制し、コラーゲンの産生低下を誘導していると考えられた。また、miRNA146b-5pは血管新生を抑制している可能性が考えられた。
現在、miRNA146b-5pがin vivoにおいて瘢痕抑制に関与している可能性が示唆されたことから、miRNA146b-5pKOラットとwild typeを用いて創傷治癒過程について比較検討を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
bFGF添加培養線維芽細胞においてmiRNA146b-5pが示した瘢痕形成抑制効果についてin vivoでの検証を行っている。現在までに、SDラットを使用して全層創傷を作成し、bFGF添加することでmiRNA146b-5pおよび創傷治癒関連因子がどのように変化するのかを検証した。その結果、bFGFはmiRNA146b-5pの発現を増強し、PDGFRαの発現を抑制することでコラーゲン産生の低下を誘導していることが示唆された。また、miRNA146b-5pは血管新生を抑制する可能性が考えられた。これらのmiRNA146b-5pのin vivoにおける瘢痕抑制効果を更に検討するため、miRNA146b-5pKOラットおよびwild typeを用いて創傷治癒過程への影響について検討中である。全層創傷を作成後、3～4日（炎症期）、6～7日（増殖期）、10～12日（瘢痕形成期）における組織学的な解析を行っている。創傷治癒の過程の炎症期における組織学的な違いは認められなかったが増殖期および瘢痕形成期において血管、膠原繊維に違いが認められた。瘢痕形成期には血管が減少するが、miRNA146b-5pKOラットではKi67(+)、CD34(+)血管内皮細胞が多く確認された。また、創傷治癒過程の各時期における膠原繊維をマッソン・トリクローム染色およびピクロシリウスレッド染色で検出を行った結果、瘢痕形成期においてコラーゲンIおよびIIIの発現に違いが認められた。しかしながら、創傷治癒の過程における組織像は個体により日数のずれがあるため、典型的な組織像を得るために更なるサンプル数が必要であると考える。
また、SDラット創傷治癒過程においてbmiRNA146b-5pが脂肪組織および周辺のエクソソームで確認されたことから脂肪幹細胞が関与していると考え、脂肪幹細胞の初代培養について検討を行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
SDラットを用いて明らかになった創傷治癒過程におけるmiRNA146b-5pの関与についてmiR146b-5pKOラットを用いてさらに検討を行う。
1. 2021年度の結果の更なる解析：miRNA146b-5pKOラットにおける創傷治癒過程の各時期における組織学的な結果について定量的に比較検討を行う。
2. 皮膚創傷部位におけるmiRNA146b-5pの瘢痕化形成への影響についての評価：創傷治癒過程の各時期におけるPDGFRα、collagen I、IIIおよびMMPなどの発現量の変化について比較検討を行い、miRNA146b-5pの創傷治癒及び瘢痕形成への影響を評価する。
3. bFGFの創傷治癒過程への影響：miRNA146b-5pはbFGFによりその発現が増加することから皮膚創傷部にbFGFを投与し創傷治癒過程にどのような影響があるかを2021年度と同様に形態学的、組織学的な比較検討を行う。同時に瘢痕形成に関連するmRNAの発現についても検討を行う。
4. 培養線維芽細胞および脂肪幹細胞におけるmiRNA146b-5pKOの影響：SDラットを用いた創傷治癒過程においてbFGF添加によりmiRNA146b-5pが線維芽細胞および脂肪細胞に発現することを確認している。miRNA146b-5pおよびWild typeのラットから培養線維芽細胞および脂肪幹細胞作成し、miRNA146b-5pがKOされることによる影響を検討する。検討方法として各培養細胞にbFGF刺激を行い、PDGFRα、collagen I、IIIおよびMMPへの影響をmRNAおよびタンパクレベルで検討を行う。
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| Causes of Carryover |
当初予定していた創傷後の採材のタイミングにばらつきが出たためどの時期に採材を行うのが適切か確認を行っていた。そのため、十分な数の免疫組織学的検索およびmRNAの検出が行えなかったため、未使用額が生じた。
今後はmiRNA146b-5pKOラットの維持、繁殖を拡大し、実験に使用できる頭数を確保する。創傷作成後、創傷治癒過程の各時期において採材、確認を行い典型的な組織像が絞られたため、更なる検討を行う予定である。次年度は抗体を追加購入し、組織学的解析に使用する。
同様にreal time PCRについてもサンプルの個体を決定し、解析を行うために更なる試薬を購入し、解析を行う。
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