2022 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of skin fibrosis suppression mechanism by miRNA targeting
| Project/Area Number |
20K09854
|
|---|
| Research Institution | Toho University |
|---|
Principal Investigator |
藤澤 千恵 東邦大学, 医学部, 講師 (10393000)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
林 明照 東邦大学, 医学部, 教授 (30218557)
赤坂 喜清 東邦大学, 医学部, 非常勤研究生 (60202511)
深澤 由里 東邦大学, 医学部, 講師 (90392331)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
|
| Keywords | 創傷治癒 / micro RNA / bFGF / KOラット |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
2021年度までにBasic fibroblast growth factor (bFGF)により誘導されたmicroRNA 146b-5p(miRNA 146ｂ-5p)がPlatelet-derived growth factor receptorα (PDGFRα)を標的とし、その発現を制御することで、瘢痕形成時における線維化を抑制する可能性をin vitroおよびin vivoにおいて示した。
2022年度はSDラットの創傷部へbFGFを添加することによりmiRNA146b-5pが脂肪組織周辺のエクソソーム内および線維芽細胞様細胞にて発現することを確認した。また、miRNA146b-5p inhibitorおよびmimicをSDラット創部へ投与する実験ではbFGFがmiRNA146b-5p発現を誘導することによりPDGFRαの発現を抑制し、コラーゲンの産生低下および血管新生を抑制している可能性が示唆された。さらに、miRNA146b-5pがin vivoにおいて瘢痕抑制へどのように影響するかについて、miRNA146b-5pKOラットを用いて検討した。miRNA146b-5pKOラットとwild typeにおける創傷治癒過程について比較検討を行った結果、創傷治癒過程においてI型、III型コラーゲンの発現および血管新生について違いが認められている。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
bFGF添加培養線維芽細胞においてmiRNA146b-5pが示した瘢痕形成抑制効果についてin vivoでの検証を行っている。現在までに、SDラットを使用して全層創傷を作成し、bFGF添加することでmiRNA146b-5pの発現が増強し、PDGFRαの発現を抑制することでコラーゲン産生の低下を誘導していることが示唆された。同時に、miRNA146b-5pは血管新生を抑制する可能性が考えられた。このmiRNA146b-5pのin vivoにおける瘢痕抑制効果を更に検討するため、miRNA146b-5pKOラットおよびwild typeを用いて創傷治癒過程への影響について検討を行った。全層創傷を作成後、3～4日（炎症期）、6～7日（増殖期）、10～12日（瘢痕形成期）における組織学的な解析としてHE染色、マッソン・トリクローム染色、免疫組織化学染色を行い比較検討した。創傷治癒の過程の炎症期における組織学的な違いは認められなかったが、増殖期および瘢痕形成期における血管、膠原繊維の発現に違いが認められた。瘢痕形成期における血管数はwild typeラットでは減少したが、miRNA146b-5pKOラットではKi67(+)、CD34(+)血管内皮細胞が多く確認された。また、創傷治癒過程の各時期における膠原繊維をマッソン・トリクローム染色およびピクロシリウスレッド染色で検出した結果、増殖期および瘢痕形成期においてコラーゲンIおよびIIIの発現に違いが認められた。しかしながら創傷治癒の過程は個体によってその進捗に差があること、創部を引っ掻くなどにより更なる炎症を引き起こすことから解析に必要と考えられる匹数を確保することに時間を要している。
|
| Strategy for Future Research Activity |
1. 2022年度の結果の更なる解析：2022年度に得られた組織学的な結果について定量的に比較検討を行うとともにmRNAの発現についても検討を行う。
2. bFGFの創傷治癒過程への影響：miRNA146b-5pはbFGFによりその発現が増加することから皮膚創傷部にbFGFを投与し創傷治癒過程にどのような影響があるかについて2022年度と同様に形態学的、組織学的な比較検討を行う。同時にmRNAの発現についても検討を行う。
3. 培養線維芽細胞および脂肪幹細胞におけるmiRNA146b-5pKOの影響：miRNA146b-5pは培養線維芽細胞をbFGF刺激することにより誘導されることを明らかにしている。miRNA146b-5pおよびwild typeのラット創傷部から培養線維芽細胞を作成し、miRNA146b-5pがKOされることによる線維芽細胞への影響を検討する。検討方法として各培養線維芽細胞にbFGF刺激を行い、PDGFRα、collagen I、IIIおよびMMPへの影響をmRNAおよびタンパクレベルで検討を行う。同様に脂肪幹細胞についても比較検討を行う。
|
| Causes of Carryover |
【次年度使用額が生じた理由】in vivoの創傷治癒実験において治癒過程に個体差が出るとともにラットの創部自傷による炎症が生じたため、実験に使用するN数が予定より下回った。そのため試薬および解析費の未使用額が生じた。
【次年度使用計画】次年度は採材した試料の解析および細胞培養試薬、ラットの飼育管理の費用に使用する予定である。
|
