2021 Fiscal Year Research-status Report
miR-125bを導入した基質小胞による癌骨転移治療の検討
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20K09879
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
南崎 朋子 広島大学, 医系科学研究科(歯), 助教 (30452593)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉子 裕二 広島大学, 医系科学研究科(歯), 教授 (20263709)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | miRNA / 骨転移 / 骨芽細胞 / miR-125b |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々はこれまでに骨芽細胞由来のmiR-125b-5pが破骨細胞分化を抑制すること(Commun Biol, 2020)や、miR-125b-5pがin vitroで乳がん細胞の増殖・遊走・浸潤能を抑制し、in vivoで海綿骨吸収やがん転移巣拡大を抑制することを明らかにした(2018年度終了基盤C研究)。
本件でmiR-125b-5pの乳がん細胞における標的遺伝子を同定するため、維持培養していたPY8119細胞（C57BL/6マウス由来乳がん細胞）にmiR-125b-5p mimicまたはnegative control mimicを導入したところ、実験当初より導入効率の低下が認められた。そこでPY8119細胞を新たに輸入・入手することとした。
miR-125b-5pはヒト・マウスとも異なる２つの染色体に由来していることから、それぞれ（miR-125b-1およびmiR-125b-2）のノックアウト（KO）マウス（C57BL/6バックグラウンド）をゲノム編集により作製した。これらのホモマウスの表現系および骨代謝への影響を解析することとしたが、miR-125b-1 KOマウスはホモ接合体で耐性致死であった（ヘテロマウスを維持中）。miR-125b-2 KOマウスは外観上特筆すべき差異はみられず、正常に出生・成長した。血液生化学的にも野生型（WT）マウスと比較して有意差はみられなかった。脛骨マイクロCT解析および骨形態計測においてもジェノタイプ間に有意な差はみられなかった。
野生型マウス主要臓器/組織におけるmiR-125b-1-3p, miR-125b-2-3p, およびmiR-125b-5pの発現を調べたところ、いずれも骨組織で高くなっており、miR-125b-2 KOマウスでは大腿骨においてmiR-125b-5pが有意に抑制されていたが、頭頂骨で有意差はみられなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
維持培養していたPY8119細胞（C57BL/6マウス由来乳がん細胞）にmiR-125b-5p mimicまたはnegative control mimicを導入したところ、実験当初より導入効率の低下が認められた。そこでPY8119細胞を新たに輸入・入手することとしたため、進捗が遅れている。また、PY8119細胞は他の乳がん細胞に比べて内因性のmiR-125b-5pレベルが高いため、別ロットでもmiR-125b-5p mimic導入による変化をみる(標的遺伝子の探索)のに適していないと考えられた場合、MCF-7細胞（ヒト乳がん細胞)に切り替えてRNA-seqを実施する可能性がある。
一方、マウス骨転移モデル（マウス尾動脈へのmiR-125bリッチ基質小胞注入）にはPY8119細胞を用いていることから、PY8119細胞でRNA-seqを実施するのが望ましいと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、乳がん細胞におけるmiR-125b-5pの標的遺伝子の探索を行う。再現性の確認された標的遺伝子(複数の可能性あり)へのmiR-125bの結合を確認するため、 レポーターアッセイを行う。(=標的遺伝子の同定)
乳がん細胞で標的遺伝子をノックダウンあるいは過剰発現し、miR-125b mimicトランスフェクション時に確認されたがん細胞の増殖・浸潤・遊走能抑制作用 (2018年度終了基盤C研究)と同様あるいはミラーイメージとなることを確認する。また、標的遺伝子の下流因子について、がん細胞の増殖・浸潤・遊走能に関 する既存の報告およびデータベースを用いて調べ、そのmRNA・タンパクレベルを解析する。
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