2020 Fiscal Year Research-status Report
ガウシアルシフェラーゼを用いたインスリン分泌解析の新展開
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20K09886
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| Research Institution | Aichi Gakuin University |
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Principal Investigator |
鈴木 崇弘 愛知学院大学, 歯学部, 教授 (70298545)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
横川 慧 愛知学院大学, 薬学部, 助教 (40804406)
古野 忠秀 愛知学院大学, 薬学部, 教授 (80254308)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 生物発光イメージング / インスリン分泌 / ガウシアルシフェラーゼ / 開口分泌 / エキソサイトーシス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
糖尿病発症の鍵となる周期性インスリン分泌の破綻を解明するための有用な解析手法の確立を目的として、高い比発光活性かつ分子量最小の分泌型発光酵素であるガウシアルシフェラーゼ（Gaussia Luciferase, GLase）をプローブとして、生物発光法による新たなインスリン分泌の可視化法と定量解析系を開発することに取り組んでいる。我々はこれまでに、インスリンとGLaseの融合タンパク質（Insulin-GLase）をレポータータンパク質に用いて、独自開発の「分泌タンパク質のビデオレート生物発光イメージング法」により、生細胞からの周期性インスリン分泌動態を可視化することに成功している。本手法を基盤として、膵島と同様に、細胞塊（スフェロイド）で周期性インスリン分泌を示すInsulin-GLase定常発現ラット膵β細胞株であるiGL細胞を樹立しており、広く利用され始めている。
インスリンと融合させるGLase の cDNAについては、ヒトで高頻度に利用されるコドンのみを使用した最適化遺伝子（pGLuc）を用いることで、効率の良い発現が得られた。さらに、単離ラット膵島やiGL細胞株の培養条件を検討し、ポリDリジンコートと比較して、マトリゲルコートしたディッシュで培養（2日程度）する方が、周期性インスリン分泌の観察に適していた。また、iGL細胞を用いて、薬物スクリーニング解析に有用なマイクロプレートを用いた多検体解析に適した細胞培養条件と発光定量条件の検討を進めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
新たなインスリン分泌の解析法開発の基盤として、周期性インスリン分泌を解析するために適した単離ラット膵島および膵β細胞株の培養条件を構築することができた。さらに、今後新たにインスリンを標識するためのコドン最適化GLase遺伝子として、pGLucの有用性が確認できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
Insulin-GLase融合タンパク質に用いるGLase遺伝子として、pGLucを用いた新たな周期性インスリン分泌の可視化解析系および定量解析系の開発に取り組む。特に、生理的な周期性インスリン分泌を詳細に解析するために、単離膵島レベルでの解析に注力する。
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| Causes of Carryover |
順調に研究を進めることができたことから、研究費を残す形となった。単離膵島を得るためのラットの購入および飼育や、発光基質の使用を充実させることで、研究を推進する。
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