2021 Fiscal Year Research-status Report
Neuro-immunological mechanism of retrogradely-transported peptides in oral diseases
| Project/Area Number |
20K09893
|
|---|
| Research Institution | Kyushu Dental College |
|---|
Principal Investigator |
小野 堅太郎 九州歯科大学, 歯学部, 教授 (40316154)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
人見 涼露 日本大学, 歯学部, 講師 (70548924)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
|
| Keywords | 口内炎疼痛 / 神経ペプチド / 神経軸索 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
我々のグループはこれまでラット口内炎モデルにおける疼痛メカニズムについて検討してきた。口内炎部の炎症症状は神経へ種々の刺激となり疼痛関連TRPチャネルが関与することを明らかにしてきた。近年、神経免疫学の進展により神経系から免疫系への影響があることが明らかにされてきた。三叉神経節に対するマイクロアレイ解析を行い、口内炎モデルで著明な発現増加を示したHamp、Reg3bおよびSerpina3nの3遺伝子（抗菌・免疫関連ペプチドをコード）に本研究では注目した。この3遺伝子により産生されたペプチドが末梢で放出された際に、免疫機能および疼痛発生にどのような影響をもたらすのかを明らかにすることが本研究の目的である。
in vivo実験ではラットを用いて、口内炎モデル、歯牙移動モデル、下歯槽神経切断による神経障害性疼痛モデルを使用する。各モデルにおける3遺伝子の三叉神経節での発現変化を追い、蛍光免疫染色法にてペプチドの輸送について検討する。さらには、3ペプチドをラット口腔粘膜に投与し、免疫組織化学法による免疫応答、および電気生理学的手法による侵害受容神経での応答を確認する。
in vitro実験では、軸索ガイダンス標本における遺伝子転写およびペプチド放出について検討する。AXISシステムを用いて、通法により単離したラット三叉神経節ニューロンを神経栄養因子とグリア由来神経栄養因子を用いて軸索ガイダンスを行う。この標本では神経構造においてin vivoと相似性の高い実験系を提供する。この実験系により、in vivoでは不可能な解析が可能になると考えている。
両実験系からの結果を組み合わせることで、末梢神経からの抗菌・免疫関連ペプチド分泌による免疫系調節および疼痛発現機序が明らかになると思われる。本研究から得られる結果は、将来、新規の治療法や新薬の開発に繋がることが期待される。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
2020年度は、新規に歯牙移動モデルと下歯槽神経切断による神経障害性疼痛モデルを手技的に確立することができた。これらのモデルより摘出した三叉神経節をサンプルとして定量性RT-PCRを行い、Hamp、Reg3bおよびSerpina3nの3遺伝子が共通して発現増加していることを確認した。さらに、侵害受容2次ニューロンからの細胞外活動電位記録のため、口腔前庭粘膜からの侵害受容を延髄のどこの部位が最も応答するのかを調べた。口腔前庭粘膜にカプサイシン刺激を行い、2時間後に延髄を摘出して連続切片を作製した。神経興奮マーカーであるc-Fosタンパクを指標として検討したところ、神経活動が最も豊富な部位を特定することができた。その部位からの細胞外電気記録によって、ヘプシジンはWDRニューロンにおける侵害機械刺激応答を増強する作用を示した。In vitro実験では、単離ラット三叉神経節ニューロンに対する神経栄養因子とグリア由来神経栄養因子の濃度検討を行った。
2021年度は、細胞外電気記録の例数を追加し、統計解析を行った。また、前年度失敗していたHampにコードされるヘプシジンの蛍光免疫染色の実験条件を変更することで成功することができた。クエン酸オートクレーブ処理によりヘプシジン染色像が得られ、口内炎モデルの三叉神経節における発現増加を確認した。しかし、口腔粘膜支配神経標識のために注入した逆行性トレーサーがクエン酸オートクレーブ処理により消失してしまった。現在は、ウエスタンブロッティングでの検討を進めている。In vitro実験では、前年度から課題となっているAXISシリコンチャンバーでの培養に成功しておらず、まだ効率的な培養実験手順を見出していない。
|
| Strategy for Future Research Activity |
AXISシリコンチャンバーでの単離三叉神経節ニューロン培養は、2年間種々の方法を試みたがいずれも満足いく成果を出せなかった。本実験系の確立は有用な情報をもたらすだろうが、研究期間内に成功することは困難と判断した。既に神経栄養因子とグリア由来神経栄養因子の適切な作用濃度は決定しているため、単離三叉神経節ニューロンを播種し、神経軸索の放射状伸長後に実験を行う。AXISとは異なり、この実験系ではニューロン全体への刺激となってしまうが、Interleukin-6や高濃度KCl（脱分極）およびリポポリサッカライド投与を行い、定量性RT-PCRによるHamp、Reg3bおよびSerpina3nの3遺伝子の発現増加および免疫染色法による蛋白質発現について検討する。
2021年度ではTRPA1ノックアウトラットを歯科疾患モデル適用する予定であったが、予備実験により遺伝的背景の調整が必要であることがわかり、交配してようやく7世代目が生まれてきている。実験に使用できるのは2022年6月からを予定している。TRPA1は口内炎疼痛のキーとなるチャネル分子であり、口内炎を作製しても疼痛がないと予想される。疼痛がないということは、侵害受容神経での活動電位発生がないことを意味するため、標的ペプチドの末梢放出がない状態となる。ヘプチジン免疫染色により三叉神経節ニューロンでの発現変化について野生型モデルとの比較を行う。さらに、口内炎粘膜部と歯根膜部のHE組織標本を作製し、免疫細胞の浸潤程度について評価する。これにより逆行性ペプチド輸送の免疫応答性への影響について明らかにすることができる。
|
Research Products
(1 results)
